1、急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì),1,一、急性毒性,急性毒性指人或動(dòng)物一次或24 h之內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后，在短期內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括致死效應(yīng)。,2,一次：指瞬間給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒，如經(jīng)口、經(jīng)靜脈注射染毒。 24 h之內(nèi)多次：指外源化學(xué)物毒性過(guò)低，需給予動(dòng)物較大劑量。,3,急性毒性效應(yīng)出現(xiàn)的快慢和毒性反應(yīng)的強(qiáng)度與外源化學(xué)物的性質(zhì)和染毒劑量的大小有關(guān)。 如：丙烯腈，過(guò)氧化二碳酸二環(huán)己酯,4,丙烯腈經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì),5,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?評(píng)價(jià)丙烯腈的毒性作用，求出半數(shù)致死量LD50，并根據(jù)LD50進(jìn)行急性毒性分級(jí)， 掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組的方法和經(jīng)口灌胃的技術(shù)。 觀察丙烯腈急性中毒癥狀；為后續(xù)試驗(yàn)提供依據(jù)；為毒理學(xué)機(jī)

2、制研究提供線索。,6,器材與試劑,1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠（健康成年小鼠） 2、實(shí)驗(yàn)器材 灌胃針、注射器、吸管、容量瓶、燒杯、滴管、電子天平、動(dòng)物體重秤、外科剪刀、鑷子 3、實(shí)驗(yàn)試劑 丙烯腈、苦味酸酒精飽和液、伊紅染液,7,實(shí)驗(yàn)方法,1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 2、劑量設(shè)計(jì)及隨機(jī)化分組 3、受試物的配制 4、染毒途徑的選擇 5、毒性反應(yīng)的觀察與LD50的計(jì)算 6、急性毒性的評(píng)價(jià),8,1、物種和品系 對(duì)外源化學(xué)物毒性反應(yīng)與人近似易于飼養(yǎng)管理 方便實(shí)驗(yàn) 操作易于獲得 繁殖生育力強(qiáng) 數(shù)量較大能夠保障 品系純化，價(jià)格低廉。,一、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇,9,2、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡與體重,動(dòng) 物 大鼠 小鼠 豚鼠 兔 犬

3、貓 成年年齡（周） 3 2 2 34 34 34 體重（克） 150 15 250 1.5kg 715kg 1kg 壽命（年） 23 23 68 49 1520 1012,10,動(dòng)物數(shù)量：動(dòng)物6組，1-5組為實(shí)驗(yàn)組，6組為蒸餾水對(duì)照組 性別：雌雄各半 年齡：成年動(dòng)物,生理與健康狀況：未產(chǎn)未孕者、健康動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的預(yù)檢 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥前禁食處理。,3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般要求,11,健康動(dòng)物標(biāo)志 發(fā)育正常、體態(tài)豐滿、外觀無(wú)畸形； 被毛濃密、貼順有光澤、不蓬亂； 胸闊寬闊、脊柱不弓不彎； 眼睛明亮； 表皮無(wú)潰瘍、無(wú)結(jié)痂（注意尾巴）； 各天然孔干凈、無(wú)分泌物； 行動(dòng)靈活、反應(yīng)敏捷。,12,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)記

4、,染色法 編號(hào)方法：小鼠頭部為1號(hào)，順時(shí)針編號(hào)，用苦味酸編個(gè)位數(shù)，用伊紅編十位數(shù)。,13,14,染色法,優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)單方便，不痛苦，無(wú)損傷。 缺點(diǎn)： 時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，染色劑易褪色； 標(biāo)記容易模糊不清。,15,劑量選擇及分組,劑量選擇 廣泛查閱文獻(xiàn)資料，估計(jì)毒性中值 預(yù)試，求出待測(cè)化學(xué)物0 %100 %或 10 %90 %的大致致死劑量范圍 設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組,16,預(yù)實(shí)驗(yàn)：,總的原則是先用少量動(dòng)物，以較大的劑量間距染毒，求出粗略的致死劑量范圍，即確定受試動(dòng)物全部致死的最小劑量（b）和全部不致死的最大劑量（a），即求出待測(cè)化學(xué)物0 %100 %的大致致死劑量范圍，然后在這個(gè)劑量范圍內(nèi)按幾何級(jí)數(shù)的

5、間距設(shè)計(jì)57個(gè)劑量組，組間劑量呈等比級(jí)數(shù)（r），其比值為1.21.5。進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。,17,通過(guò)預(yù)試，找出受試化學(xué)物引起動(dòng)物死亡的大致劑量范圍，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組。 按下式設(shè)計(jì)劑量組：,式中：r相鄰兩組劑量的比值，一般為1.21.5， b最低全致死劑量量， a最高不致死劑量， n設(shè)計(jì)的組數(shù)。 分組恰當(dāng)與否也是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的條件之一。因?yàn)榻M數(shù)過(guò)多，需要消耗較多的動(dòng)物，還可能出現(xiàn)較大劑量組動(dòng)物死亡率低于較小劑量組；組數(shù)過(guò)少，不能較精確求出LD50。,18,根據(jù)公比(r)計(jì)算各組劑量 各組劑量分別為 第一組：a 第二組：a r 第三組：a r2 第四組：a r3 第五組：a r4

6、 第六組：a r5,19,隨機(jī)化分組,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，從隨機(jī)數(shù)字表上任意橫行或縱行的任意數(shù)字開始，順序取下數(shù)字，標(biāo)于每個(gè)動(dòng)物號(hào)下，然后用計(jì)劃組數(shù)去除隨機(jī)數(shù)字，所得余數(shù)即為所屬組別。,20,以20只動(dòng)物的完全隨機(jī)分配為例,21,完全隨機(jī)分配后各組所屬動(dòng)物號(hào),22,20只動(dòng)物完全隨機(jī)分配的結(jié)果,23,受試物的配制方法,（1）受試化學(xué)物的量?。?固體受試物用稱量法，液體受試物用稱量法或吸量法。 稱量法：取一定量的受試物放入已知重量的容器內(nèi)，稱重，定容，計(jì)算濃度mg/ml，備用。 吸量法：依設(shè)計(jì)劑量計(jì)算出應(yīng)吸取液態(tài)受試物的容積，加入容量瓶中，用溶劑加至刻度。,24,吸量法，計(jì)算公式為：X 式中： X應(yīng)

7、吸取受試物的容積； A設(shè)計(jì)要求的受試物濃度（ mg/ml ）； V容量瓶容積（ml）； d受試化學(xué)物比重；,25,受試物的配制方法,（2）受試化學(xué)物的稀釋 等濃度稀釋法： 等容量稀釋法：,26,等濃度稀釋法,將受試物配制成一種濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所給受試物的體積不同，劑量越高，所用的體積越大；劑量越低，所用的體積越小。比如某受試物的試驗(yàn)劑量分別為100、200、400和800mg/kg，受試物配制成10 mg/ml，每組動(dòng)物每10g體重分別給與0.1、0.2、0.4和0.8 ml。,27,等容量稀釋法,將受試物配制成不同濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所給受試物的體積相同，劑量越大

8、，受試化學(xué)物配制的濃度越高。上例中，若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,則應(yīng)配制成4個(gè)不同濃度,即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。,28,染毒途徑的選擇,經(jīng)消化道染毒：經(jīng)口灌胃法 采用專用小鼠灌胃針。 左手抓住動(dòng)物雙耳后至背部的皮膚，將動(dòng)物固定成垂直體位，腹部面向操作。 右手持注射器，將針頭由動(dòng)物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，一旦感覺(jué)阻力消失，即深人至胃部。 如遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，千萬(wàn)不能強(qiáng)行插入，以免穿破食，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物 立即死亡。,29,觀察指標(biāo),中毒癥狀：確定靶器官 行動(dòng)：不安定、

9、多動(dòng)、發(fā)聲； 神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：舉尾、振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常； 自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：眼球突出、流涎、流淚、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸。 死亡和死亡時(shí)間 病理學(xué)檢查及其他指標(biāo),30,LD50的計(jì)算（改良寇氏法）,當(dāng)急性毒性試驗(yàn)的最大劑量死亡率為100%，最小劑量的死亡率為0%；各組動(dòng)物數(shù)相等；各劑量組的組距等比或劑量對(duì)數(shù)等差時(shí)，用下述基本公式計(jì)算LD50：,31,當(dāng)不含0%和100%死亡率時(shí)，用下式計(jì)算LD50：,Xm最大劑量對(duì)數(shù) P各劑量組死亡率 Pm最高死亡率 q各組劑量存活率，q=1-p,以上各式中：i組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)劑量之差,Pn最低死亡率 p各劑量組死亡率之和 n各組動(dòng)物數(shù),32,LD50的局限性,消耗動(dòng)物量大 獲得的信息有限 動(dòng)物死亡和觀察的癥狀不足以反應(yīng)生理學(xué)、血液學(xué)和其它化驗(yàn)檢查所提供的毒性信息 有許多因素影響LD50值的測(cè)定，實(shí)際上測(cè)得的LD50是近似值,33,急性毒性