1、第三章 發(fā)酵液預(yù)處理,兩個問題,1、為什么要進行發(fā)酵液的預(yù)處理? 不僅在于分離菌體和其他懸浮顆粒，還著眼于除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于提取和精制后繼各工序的順利進行。 2、如何選擇合適的預(yù)處理方法? 各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預(yù)處理方法的選擇也有不同。大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，也有少數(shù)產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有。 對于胞內(nèi)產(chǎn)物，經(jīng)預(yù)處理應(yīng)盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)固液分離除去固相；對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)首先收集菌體或細胞，經(jīng)細胞破碎后，目的產(chǎn)物進入液相，隨后再將細胞碎片分離。,第一節(jié) 發(fā)酵液過濾特性的改變,發(fā)酵液的特性,特性： 發(fā)酵產(chǎn)物濃

2、度較低，大多為110%，懸浮液中大部分是水； 懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大； 固體粒子可壓縮性大； 液相粘度大，大多為非牛頓型流體； 性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。 這些特性，使得發(fā)酵液的過濾與分離相當困難。 物理化學(xué)方法,一、降低液體粘度,常用方法： （1）加水稀釋法：有效（稀釋后過濾速率提高的百分比必須大于加水比才能認為有效） （2）加熱法：同時，在適當溫度和受熱時間下使蛋白質(zhì)凝聚，進一步改善了過濾特性。 嚴格控制加熱溫度與時間,二、調(diào)整PH,等電點法 對某一具體的單元操作的作用：改變大分子物質(zhì)的電荷特性，減少堵塞和污染，如膜過濾。 一

3、些物質(zhì)（如細胞、細胞碎片、膠休物質(zhì)等）在某個PH下也可能趨于絮凝，有利于過濾進行。,三、凝聚與絮凝,凝聚與絮凝其處理過程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液中，改變細胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進行分離。 1、概念上的差別 凝聚是指在電解質(zhì)的作用下，由于膠粒之間雙電層排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。絮凝則是指在某些絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。,2、凝聚,膠體粒子(10-100nm)中性鹽促進下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm） 機理： （1）中和粒子表面電荷 （2）消除雙電層結(jié)構(gòu) 發(fā)酵液的帶電現(xiàn)象 發(fā)酵液

4、中的細胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，帶電的原因很多，主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。,發(fā)酵液的帶電現(xiàn)象雙電層結(jié)構(gòu),通常發(fā)酵液中細胞或菌體帶有負電荷，由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒于（即正離子）被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。 但是這些正離子還受到使它們均勻分布開去的熱運動的影響，具有離開膠粒表面的趨勢，在這兩種相反作用的影響下，雙電層就分裂成兩部分，在相距膠核表面約一個離子半徑的stern平面以內(nèi)，正離子被緊密束縛在膠核表面，稱為吸附層或stern層；在stern平面以外，剩余的正離子則在溶液中擴散開去，距離越遠，濃度越小，最后達到主體溶液的平均濃度

5、，稱為擴散層。這樣就形成了擴散雙電層的結(jié)構(gòu)模型。,膠體雙電層結(jié)構(gòu),凝聚值或凝聚價,在發(fā)酵液中加入具有高價陽離子的電解質(zhì)，由于能降低電位和脫除膠粒表面的水化膜，就能導(dǎo)致膠粒間的凝聚作用。 電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚值或凝聚價來表示，使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mmol/L），稱為凝聚值或凝聚價。,Schulze-Hardy法則叔米-哈第法則,反離子的價數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能力越強。 陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序為A13Fe3+ HCa2十Mg2+K+Na+Li+，常用的凝聚劑電解質(zhì)有： Al2(SO4)318H20（明礬）；AlC136H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO

6、3等。,3、絮凝,大分子絮凝劑將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團的過程。 機理：架橋作用。絮凝劑通過靜電引力、范德華力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)接時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。,高分子絮凝劑的吸附架橋作用,常用的絮凝劑,聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）類和聚乙烯亞胺（polyethyleneimine）衍生物，根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型（含有羧基）和陽離子型（含有胺基）三類。由于聚丙烯酰胺類絮凝劑具有用量少，一般以ppm計量，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快以及種類多

7、等優(yōu)點，所以適用范圍廣。 聚丙烯酸類陰離子絮凝劑和聚苯乙烯類衍生物。 無機高分子聚合物也是較好的一類絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等。,常用的絮凝劑,天然有機高分子絮凝劑，如殼聚糖和葡聚糖等聚糖類，還有明膠、骨膠、海藻酸鈉等。 微生物絮凝劑是近年來研究和開發(fā)的新型絮凝劑，它是一類由微生物產(chǎn)生的具有絮凝細胞功能的物質(zhì)。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑和天然絮凝劑與化學(xué)合成的絮凝劑相比，最大的優(yōu)點是安全，無毒和不污染環(huán)境。,絮凝劑應(yīng)用優(yōu)化,用量控制：最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋時所用的絮凝劑量。 pH 控制 固體濃度與粒子尺寸分布 電解質(zhì)含量 后續(xù)工藝要求

8、,凝聚和絮凝在發(fā)酵液預(yù)處理中的應(yīng)用,凝聚和絮凝技術(shù)能有效的改變細胞菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使其聚集起來，增大體積以便固液分離，常用于菌體細小而且黏度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中。,四、加入助濾劑,1、助濾劑及其作用：最常用的硅藻土 2、使用方法：兩種 （1）在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑 （2）直接加入發(fā)酵液 也可兩種方法同時兼用 3、選擇及使用要點 （1）根據(jù)目的產(chǎn)物選擇助濾劑品種 （2）根據(jù)過濾介質(zhì)和過濾情況選擇助濾劑品種 （3）粒度選擇：必須與懸浮液中固體粒子的尺寸相適應(yīng) （4）使用量的選擇：合適,五、加入反應(yīng)劑,不影響目的產(chǎn)物 作用機理：加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，生

9、成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。 正確選擇反應(yīng)劑和反應(yīng)條件，能使過濾速率提高310倍。,第二節(jié) 發(fā)酵液的相對純化,為什么要純化？ 對于不同的雜質(zhì)，要選擇不同的方法。,一、高價無機離子的除去,發(fā)酵液中主要的無機離子有Ca2+，Mg2+，F(xiàn)e2+ 1、 Ca2+ 的除去 為了去除鈣離子，宜加入草酸。但草酸溶解度較小，故用量大時，可用其可溶性鹽，如草酸鈉。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液（也稱為原液）質(zhì)量。但草酸價格較貴，應(yīng)注意回收。如四環(huán)類抗生素廢液中，加入硫酸鉛，在60下反應(yīng)生成草酸鉛。后者在9095下

10、用硫酸分解，經(jīng)過濾、冷卻、結(jié)晶后可以回收草酸。,2、 Mg2+，F(xiàn)e2+ 的除去,草酸鎂的溶解度較大，故加入草酸不能除盡鎂離子。要除去鎂離子，可以加入三聚磷酸鈉Na5P3O10，它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物： Na5P3O10 Mg2+ MgNa3P3O10 2Na+ 用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。 要除去鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍沉淀: 4Fe3+ + 3K4Fe(CN)6 Fe4Fe(CN)63+ 12K+,二、雜蛋白質(zhì)的除去,前面介紹的方法，在改善發(fā)酵液過濾特性的同時，也除去了一部分雜蛋白質(zhì)。下面再介紹幾種常用的方法： （1）沉淀法：等電點沉淀法 蛋白質(zhì)一般以膠

11、體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中，膠體粒子的穩(wěn)定性和其所帶電荷有關(guān)。和氨基酸等兩性物質(zhì)一樣，蛋白質(zhì)在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負電荷，而在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，可使其產(chǎn)生沉淀而除去，稱為等電點沉淀法。,（2）變性法：,蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過程稱為變性。變性蛋白質(zhì)溶解度較小。 最常用的使蛋白質(zhì)變性的方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低，加快過濾速度。 檸檬酸發(fā)酵液，采用加熱至80以上，使蛋白質(zhì)變性凝固和降低發(fā)酵液粘度，從而大大提高了過濾速度。 變性的其它方法：大幅度調(diào)節(jié)PH，加有機溶劑 鏈霉素生產(chǎn)中，采用調(diào)pH至酸性（pH3.0），加熱至70，維持半個小時的方法來去除蛋白

12、質(zhì)，能使過濾速度增大10-100倍，濾液粘度可降低1/6。 注意：加熱法只適合對熱穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端PH會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且消耗大量酸堿；而有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。,（3）吸附法,利用吸附作用也可除去蛋白質(zhì)。 四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3Fe(CN)52的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)，利用此法除蛋白質(zhì)已取得很好的效果。 在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過濾速度。,第三節(jié) 固液分離工程,本節(jié)介紹細胞分離、目標產(chǎn)物釋放以及蛋

13、白質(zhì)復(fù)性的各種主要方法。,固液分離的目的和方法,包括兩方面： 收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細胞或菌體，分離除去液相，或者是收集含生化物質(zhì)的液相，分離除去固體懸浮物，如細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和它們的絮凝體等。 常用的方法：過濾和離心分離等化工單元操作。,一、重力沉降,雖然簡便易行，但速度很慢。 可先用凝聚或絮凝技術(shù)使顆粒變大，再使用。 使用場合有限,二、離心分離,借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)。 最廣泛使用的非均相分離手段，細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離等常用離心分離。 超速離心技術(shù)已成為分離、純化、鑒別和各種生物大分子的重要手段之一,1、沉降系數(shù)S,單位離

14、心力作用下粒子的沉降速度，以Svedberg表示，簡稱S。1S=110-13s 離心沉降速度 沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。是離心設(shè)備的一個重要技術(shù)指標是其所能達到的離心力與重力的比值，稱為分離因數(shù)。,2、離心力,離心力(Centrifugal force) ：離心力作為真實的力根本就不存在，在非慣性系中為計算方便假想的一個力。 相對離心力（Relative centrifugal force ，RCF） ：是實際離心力轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。 注：n(rpm)應(yīng)折換成 轉(zhuǎn)/秒,3、離心機的種類與用途,按轉(zhuǎn)速分：常速（低速）、高速和超速 （1）、常速離心機 8000

15、r/min，RCF1104g 用途：分離細胞、細胞碎片、培養(yǎng)基殘渣及粗結(jié)晶等較大顆粒 （2）、高速離心機 1104g2.5104 r/min ，RCF 1104g105g 用途：分離各種沉淀物、細胞碎片及較大的細胞器等 高速冷凍離心機,（3）、 超速離心機,2.5104 r/min8104 r/min ，RCF 5105g或更高 結(jié)構(gòu)：離心管帽、冷凍裝置和溫控系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、安全保護系統(tǒng)、制動系統(tǒng)、指示儀表等。 按用途分： 制備用超速離心機：分離純化生物大分子、細胞器和病毒等 分析用超速離心機：測定樣品純度（根據(jù)紫外吸收率或折光率等判斷）、沉降系數(shù)、相對分子量,4、離心方法的選擇,對于常速和高

16、速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和時間，就能達到分離效果。 超速離心的離心方法：差速離心、密度梯度離心和等密度梯度離心,（1）差速離心,采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。,（2）密度梯度離心,樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 密度梯度系統(tǒng)：梯度介質(zhì)有足夠大的溶解度，不與分離組分反應(yīng)，不會引起分離組分的凝集、變性或失活。 常用介質(zhì)：蔗糖、甘油等。 樣品鋪在密度梯度溶液表面，離心后形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。,梯度混合器,（3）等密度離心,當欲

17、分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時，不同浮力密度的物質(zhì)顆粒在離心力作用下一直移動到與各自浮力密度相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶。 等密度離心常用的介質(zhì)：銫鹽，如CsCl，Cs2SO4，CsBr,5、離心條件的確定,離心力（轉(zhuǎn)速） 離心時間 溫度 pH值,6、離心機械,管式離心機 分為液液分離的連續(xù)式管式離心機和液固分離的間歇式管式離心機。 結(jié)構(gòu)簡單 轉(zhuǎn)速很高 有利于蛋白質(zhì)的分離 間歇操作,碟片式離心機,是一種應(yīng)用最廣泛的離心機 有一個密封的轉(zhuǎn)鼓，內(nèi)裝十至上百個錐頂角為60100錐形碟片。 固體的沉降距離極短，分離效果較好。 碟片間的距離一般為0.52.5mm,與被分離物料的

18、性質(zhì)有關(guān)。,分類,人工排渣的碟片離心機 噴嘴排渣的碟片離心機 活門（活塞）排渣的碟片離心機 活門排渣的噴嘴碟片式離心機（這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%30%,故可使分離因素達15000 左右，該機型可用于酶制劑，疫苗和胰島素生產(chǎn)中分離物的澄清，醇的生產(chǎn)中細菌的采集以及r-DNA中采集和澄清。,3、過濾（Filtration),概念,過濾操作是借助于過濾介質(zhì)，在一定的壓力差P作用下，將懸浮液中的固體粒子截留，而與液體分離的技術(shù)。衡量過濾特性的主要指標是濾餅的重量比阻rB，它表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。對于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)，但對

19、于可壓縮性濾餅，比阻rB，是操作壓力差的函數(shù),影響過濾的因素,菌種：真菌，放線菌，細菌 培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉，后期加油，培養(yǎng)基未用完 發(fā)酵時間：菌絲自溶前放罐 黏度（發(fā)酵液）,過濾的難易程度,根據(jù)濾餅的重量比阻值，可衡量各種不同發(fā)酵液過濾的難易程度。 一般，真菌的菌絲比較粗大，如青霉素的重量比阻為（0.150.20） l012 mkg左右，發(fā)酵液容易過濾，常不需特殊處理。放線菌發(fā)酵液菌絲細而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀，如鏈霉素重量比阻為20001012m/kg左右，過濾較困難，一般需經(jīng)預(yù)處理。,改善過濾方法,分類：,（1）澄清過濾；（2）濾餅過濾 注意：兩者的區(qū)別 下面介紹板框過濾和真空轉(zhuǎn)鼓過濾和錯流過濾。,板框過濾,在發(fā)酵工業(yè)中廣泛應(yīng)用 框的形式,在板與框的角上均開有孔，組合后即構(gòu)成供濾漿和洗滌水流通的孔道。濾框上角的孔有小通道與框內(nèi)的空間相通，為濾漿的進入口。濾框的兩側(cè)覆以濾布，圍成容納濾漿和濾餅的空間。濾板有洗滌板和非洗滌板兩種，它們的結(jié)構(gòu)與作用有所不同，圖中圖(a)表示的為非洗滌板，圖(b)為洗板，非洗滌板右下角的孔與板面兩側(cè)相通，可排出洗滌液；洗板左上角的孔與板面的兩側(cè)相通，洗滌液可以由此通入。,板和框的結(jié)構(gòu),板框過濾機,真空轉(zhuǎn)鼓過濾,過濾原理及設(shè)備,錯流過