1、a,1,化學(xué)化工學(xué)院,a,2,液相色譜分析是在經(jīng)典的液體柱色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論；在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快、分離效率高和操作自動化，這種柱色譜技術(shù)被稱做高效液相色譜法。,高效液相色譜分析概述,a,3,a,4,葉綠素的柱色譜,a,5,三組分混合物的分離,a,6,在C18柱中，三組分混合物流出色譜柱的順序?yàn)椋狠粒?lián)二苯、蒽。,當(dāng)試樣混合物進(jìn)入色譜柱后，就在固定相和流動相之間不斷地進(jìn)行分配平衡。不同的化合物，分子結(jié)構(gòu)不同，存在理化性質(zhì)的差異，所以在兩相中存在的濃度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，沖洗出柱子的時(shí)間就長，反之則短。這與分配系數(shù)有關(guān)

2、： K = 化合物在固定相中的濃度C固 化合物在流動相中的濃度C流 K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用強(qiáng)，后流出柱子。,a,7,a,8,鍵合相-反相色譜,a,9,1. 概 述,色譜法：(chromatography)： 以試樣組分在固定相和流動相間的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據(jù)而建立起來的各種分離分析方法稱色譜法。,幾個(gè)概念 色譜柱：進(jìn)行色譜分離用的細(xì)長管。 固定相：管內(nèi)保持固定、起分離作用的填充物。 流動相：流經(jīng)固定相的空隙或表面的沖洗劑。,a,10,1-4 高效液相色譜法的特點(diǎn),一 高壓 液相色譜以液體作為流動相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為

3、了能迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。在現(xiàn)代液體色譜中供液壓力和進(jìn)樣壓力都很高，一般可達(dá)到150300kgcm2，甚至可達(dá)700kcm2以上。,a,11,二 高速 高效液相色譜所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液體色譜快得多，一般可達(dá)l10mLmin， 個(gè)別可高達(dá)100mLmin以上，這已近似于氣相色譜的流速。,三 高效 氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高，一般約可達(dá) 60000理論塔板米；,a,12,四 高靈敏度 紫外檢測器的最小檢測量可達(dá)毫微克數(shù)量級(10-9 g)；熒光檢測器的靈敏度可達(dá)10-11g。高效液相色譜的高靈敏度還表現(xiàn)在所需試樣很少；微升數(shù)量級的樣品就足以進(jìn)行全分析。,a

4、,13,1-5 高效液相色譜流程和設(shè)備,高效液相色譜儀一般可分為5個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下： 首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。,a,14,a,15,樣品吸收度測定吸收池示圖,a,16,紫外檢測器工作原理,a,17,a,18,進(jìn)樣閥,樣品,裝樣,廢液,淋洗液,至分離柱,定量環(huán)進(jìn)樣,（）,（）,樣品環(huán),

5、a,19,液相色譜動畫演示,a,20,二、色譜圖（chromatogram）,試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，按先后次序經(jīng)過檢測器時(shí)，檢測器就將流動相中各組分濃度變化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號，由記錄儀所記錄下的信號時(shí)間曲線或信號流動相體積曲線，稱為色譜流出曲線，或色譜圖。如圖12-2,常用術(shù)語：,1. 基線 : 在操作條件下，僅有純流動相進(jìn)入檢測器時(shí)的流出曲線。,a,21,2. 色譜峰: 當(dāng)組分隨流動相進(jìn)入檢測器時(shí)，其響應(yīng)信號大小隨時(shí)間變化所形成的峰形曲線。正常的色譜峰呈正態(tài)分布。,3.峰高與峰面積 峰高：色譜峰頂點(diǎn)與峰底之間的垂直距離稱為峰高(peak height)。用h表示。 峰面積：峰與峰底之間

6、的面積稱為峰面積(peak area)，用A表示。,a,22,21 保 留 值,一、保留時(shí)間（tR） 從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時(shí)間為保留時(shí)間，用tR表示。,a,23,2-2 色譜柱的分離效率及柱效能的評價(jià),一、塔板理論,塔板理論認(rèn)為，一根柱子可以分為n段，在每段內(nèi)組分在兩相間很快達(dá)到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。設(shè)柱長為L，理論塔板高度為H，則 H=L/n 式中n為理論塔板數(shù)。,a,24,色譜柱的分離效率（簡稱柱效），可定量地用理論塔板數(shù)N來表示。,理論塔板數(shù)一N還與柱長有關(guān)，當(dāng)比較兩不同長度的色譜柱的柱效時(shí)，應(yīng)當(dāng)比較它們在相同柱長下的V值。,理論塔板數(shù)N,a,25,可用半

7、峰高處的峰寬(半峰寬）和保留時(shí)間的關(guān)系來表示理論塔板數(shù)N，這時(shí)關(guān)系式為： N554 ( tR / Wt1/2 ) 2 2 式中： Wt1/2 -半峰寬,例如，從圖2-3，測得tR=105mm、 Wt1/2 =4mm，求得N=3789，若此柱長為250mm,折成每米的理論塔板數(shù)約為15200.,a,26,2-3 分離度及影響因素,一 分離度（分辨率) 研究色譜中有關(guān)分離問題時(shí)，首先就是要能定量地確定相鄰兩峰的分離程度。,從圖8-3可以看出，為了獲得較好的分離，就必須使最大峰值之間的距離增加，峰寬減小。,a,27,a,28,一般用Rs來定量表達(dá)相鄰兩峰的分離程度，所以Rs是色譜中兩個(gè)組分分離好壞程

8、度的標(biāo)志。要求RS1.5,tR1 tR2 Rs = 1/2(W1+W2),式中 tR1、tR2 分別為兩組分的保留時(shí)間， W1 、W2為色譜峰的峰底寬度 .,a,29,5 高效液相色譜的定性和定量分析,5-1 定性分析,在液相色譜中保留值定性的方法主要是用直接與已知標(biāo)準(zhǔn)物對照的方法。當(dāng)未知峰的保留值（t R或V R ）與某一已知標(biāo)準(zhǔn)物完全相同時(shí)，則未知峰可能與此已知標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)，特別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時(shí)，未知峰的保留值與已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值仍能完全相同，則可以基本上認(rèn)定未知峰與標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)。,a,30,5-2 定量分析,HPLC色譜定量的基本方法有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等。,外標(biāo)法

9、標(biāo)準(zhǔn)曲線法 是一種簡便、快速的絕對定量方法（歸一化法則是相對定量方法）。首先用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。,a,31,具體作法是： 用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過原點(diǎn)的直線。若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點(diǎn)，說明測定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對校正因子。,a,32,目前已普及于幾乎所有重要的分析學(xué)科領(lǐng)域和許多科研生產(chǎn)部門，高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的大分子和離子型物質(zhì)，易變質(zhì)的天然產(chǎn)物，各種高分子化合物和不穩(wěn)定化合物。,例如：蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農(nóng)藥、甾族化合物、多環(huán)芳烴、合成聚合物、瞟吟、維生素、除銹劑、防老劑等等。