1、實驗六 金黃色葡萄球菌的檢驗,2,Contents,生物學(xué)特性-菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征,3,4,電鏡照片,5,5、大多數(shù)菌株能生長在6.5-46之間（最適溫度30-37）能在pH4.2-9.3之間生長（最適pH為7.0-7.5）； 6、大多數(shù)菌株產(chǎn)生類胡蘿卜素，使細(xì)胞團呈現(xiàn)出深橙色到淺黃色，色素的產(chǎn)生取決于生長的條件，而且在單個菌株中可能也有變化,6,7、好氧生長的細(xì)胞產(chǎn)生接觸酶； 8、產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多數(shù)菌株可水解天然的動物蛋白，例如血紅蛋白、纖維蛋白、卵白、酪朊和多肽類如明膠，水解脂類、吐溫類和磷脂蛋白質(zhì)，并釋放脂肪酸 9、所有的毒株產(chǎn)生凝固酶，人和動物來源的菌株通

2、常可凝固兔、人、馬和豬的血漿。,7,致病性,金黃色葡萄球菌為條件致病菌，菌株致病力的強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶： a.溶血素：外毒素，分、四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死； b.殺白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；,8,c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān) d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌 e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、

3、E五種。,9,致病性,金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，臨床表現(xiàn)多種多樣，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。,10,致病性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病，可引發(fā)不同程度的急性胃腸炎癥狀，惡心、嘔吐最為突出而且普遍，腹痛、腹瀉次之。 當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時，經(jīng)8-10小時即可產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。,11,1、目的要求,了解食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌及腸毒素的檢測方法 觀察金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板和Baird-Parker

4、瓊脂平板上生長的菌落特征 觀察金黃色葡萄球菌產(chǎn)生血漿凝固酶現(xiàn)象,12,2、基本原理,金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。 在血平板上生長可金黃色色素使菌落呈現(xiàn)金黃色；由于產(chǎn)生溶血素使菌落周圍形成大而透明的溶血圈 在B-P平板上生長時，因?qū)嗧谒徕涍€原成碲酸鉀使菌落呈灰黑色；因產(chǎn)生脂酶使菌落周圍有一混濁帶，而在其外層因產(chǎn)生蛋白水解酶有一透明帶。,金黃色葡萄球菌型溶血,金黃色葡萄球菌在BP平板上的菌落形態(tài),13,在肉湯中培養(yǎng)時，菌體可生成血漿凝固酶并釋放于培養(yǎng)基中，此酶類似凝血酶原物質(zhì)，不直接作用到血漿纖維蛋白原上，而是被血漿中的致活劑激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原

5、變成纖維蛋白，血漿因而成凝固狀態(tài),14,葡萄球菌在自然界分布極廣，空氣、土壤、水、飼料、食品(剩飯、糕點、牛奶、肉品等)以及人和動物的體表粘膜等處均有存在，大部分不致病，也有一些致病的球菌。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬一個種。可引起皮膚組織炎癥，還能產(chǎn)生腸毒素。如果在食品中大量生長繁殖，產(chǎn)生毒素，人誤食了含有毒素的食品，就會發(fā)生食物中毒，故食品中存在金黃色葡萄球菌對人的健康是一種潛在危險 金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿凝固，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生溶血毒素，使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應(yīng)。這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。,15,腸毒素形成條件： 存放溫度，在37C內(nèi)

6、，溫度越高，產(chǎn)毒時間越短； 存放地點，通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素； 食物種類，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。,16,實驗材料,儀器材料：顯微鏡、恒溫箱、無菌吸管、無菌試管、無菌平皿、載玻片、L型涂布棒、酒精燈、接種環(huán)等 培養(yǎng)基及試劑：10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、7.5%氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Baird-parker培養(yǎng)基、無菌鹽水、BHI肉湯、兔血漿、革蘭氏染色液,17,BP平板,主要成分及作用： 氯化鋰、甘氨酸:抑制非制病性葡萄球的生長 丙酮酸鈉: 促進葡萄球菌生長 亞碲酸鉀: 抑制G-桿菌生長，可被金黃色葡萄球菌還原為碲鹽呈黑色 卵黃: 含蛋白質(zhì)、卵磷、脂

7、肪,18,檢驗程序,檢驗處理：取25g固體樣品或吸取25ml液體樣品，加入225ml滅菌生理鹽水，固體制成混濁液,吸取5ml 上述混懸液，接種于50ml 7.5氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯50ml培養(yǎng)基內(nèi)，置361培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)種血平板和B-P 平板，置361培養(yǎng)24h ，挑取血平板上金黃色（有時為白色）菌落時行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗,血漿凝固酶試驗：取新鮮兔血漿，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5ml，振蕩搖勻，置361溫箱或水浴內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽性。同時以已知陽性金黃色葡萄球菌株作為對照。,19,

8、取2 5ml 樣品，接種于225ml 7.5氯化鈉肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置361培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)種血平板和B-P 平板，置361培養(yǎng)24h ，挑取血平板上金黃色（有時為白色）菌落時行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗,血漿凝固酶試驗：吸取1：4 新鮮兔血漿0.5ml，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5ml，振蕩搖勻，置361溫箱或水浴內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽性結(jié)果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。,檢驗程序,直接計數(shù)法,20,25 mL樣品+ 225mL 7.5%氯化鈉肉湯,血平板,36 1 24h

9、,鏡 檢 營養(yǎng)肉湯,血漿凝固酶 實驗,報告結(jié)果,定性 檢測,36 1 24h,36 1 24h,36 1 6h,BP平板,21,25g樣品+ 225ml 生理鹽水,選三個連續(xù)梯度，每個梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉湯,將有生長的管劃線接種,36 1 48h,鏡 檢 營養(yǎng)肉湯,血漿凝固酶 實驗,報告結(jié)果 MPN/g(mL),定量 檢測 （MPN法）,36 1 48h,36 1 24h,36 1 6h,適用于檢測可能含有少量金黃色葡萄球菌，卻帶有大量競爭菌的樣品,梯度稀釋,22,25g樣品+ 225ml 生理鹽水,選三個連續(xù)梯度，每個梯度分別取1mL接種之至表面干燥的B-P平板（如0.4mL，

10、0.3mL，0.3mL）,平板計數(shù)（分別記錄每種類型的菌落數(shù)）,36 1 48h,鏡 檢 營養(yǎng)肉湯,血漿凝固酶實驗,報告結(jié)果 金葡菌數(shù)/g(mL),定量 檢測 （平板法）,每種類型至少選取一個菌落,36 1 24h,36 1 6h,適用于檢測金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（mL）的食品,梯度稀釋,23,形態(tài)：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.51um。 培養(yǎng)特征：在肉湯中呈混濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，有時也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在B-P平

11、板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。,24,25,26,直接計數(shù)法,吸取上述1：10 混懸液，進行10倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1ml，分別加入三塊B-P 平板，每個平板接種量分別為0.3ml、0.3ml、0.4ml，然后用滅菌L 棒涂布整個平板。如水分多不易吸收，可將平板放在361溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置361溫箱

12、培養(yǎng)。 在三個平板上點數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選五個菌落，分別接種血平板，361 24h培養(yǎng)后進行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養(yǎng)法 菌落計數(shù)：將三十平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。,27,結(jié)果,金黃色葡萄球菌革蘭氏染色鏡檢陽性，致病菌較非致病菌小，大小排列整齊。細(xì)菌繁殖時多呈多個平面的不規(guī)則分裂，堆擠成葡萄串狀。在中毒食品、膿汁或液體培養(yǎng)基中常呈單個或環(huán)狀球短鏈排列，易誤認(rèn)為是鏈球菌 血平板上菌落呈金黃色，周圍有溶血圈。在B-P平板上呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。 致病性葡萄球菌血漿凝固酶為陽性,28,注意事項,樣品中金黃色葡萄球菌計數(shù)進行10倍稀釋時要注意，每個稀釋度要更換吸管 實驗中操作者須