1、1,.,葡萄球菌屬,金黃色葡萄球菌的檢測方法,2,.,引起毒素型食物中毒 分為：金黃色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生性葡萄球菌,葡萄球菌屬（Staphylococcus）,對于加工過的食品或食品加工設(shè)備而言，此菌或其腸毒素的存在通常作為衛(wèi)生條件差的一種指標。,金黃色葡萄球菌的掃描電鏡照片,3,.,生物學特性 1、形態(tài)與染色特性 G+，無芽孢、無鞭毛、無莢膜、不運動 2、培養(yǎng)特性： 3、生化特性：MR陽性，VP弱陽性，靛基質(zhì)陰性 4、抵抗力 具有較強的抵抗力，80 30min 5、抗原結(jié)構(gòu) 蛋白抗原表面抗原，無特異性。 多糖抗原半抗原，有型特異性,2.2 葡萄球菌屬（Staphylococcus）

2、,4,.,一、金黃色葡萄球菌的生物學特性 1、形態(tài)與染色：(staphylococcus aureus) G+，無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜。 典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8 mm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。 附： 金黃色葡萄球菌的顯微照片 金黃色葡萄球菌的染色照片 金黃色葡萄球菌的掃描電鏡照片 金黃色葡萄球菌的透射電鏡照片,食品中金黃色葡萄球菌的檢驗,5,.,2、培養(yǎng)特性： 金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，加少量葡萄糖或血液生長更旺盛需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37，最適生長pH 7.4。 金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在7.515%NaCl肉湯中生長。,6,.

3、,金黃色葡萄球菌 在甘露醇鹽平板上的菌落,7,.,2.2.2 生物學特性 6、毒素和酶 腸毒素形成條件： 存放溫度：在37內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時間越短； 存放地點：通風不良氧分壓低易形成腸毒素； 食物種類：含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時含 一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。,2.2 葡萄球菌屬（Staphylococcus）,8,.,金黃色葡萄球菌的檢驗 GB 4789.10-2010 第一法 金黃色葡萄球菌的定性檢測 第二法 金黃色葡萄球菌 Baird-Parker 平板計數(shù) 第三法 金黃色葡萄球菌MPN 計數(shù),9,.,第一法金黃色葡萄球菌定性檢驗,國家標準檢驗方法GB4789.10-94,10,.

4、,操作步驟： 1、樣品的處理 2、增菌和分離培養(yǎng) 3、鑒定：染色鏡檢、血漿凝固酶試驗 4、腸毒素的測定 5、結(jié)果報告,11,.,1、樣品的處理 稱取25g樣品至盛有225mL7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000r/min 均質(zhì)1min2min，或放入盛有225mL7.5 %氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨 大豆肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min。若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。,12,.,2、增菌

5、和分離培養(yǎng) 1）將上述樣品勻液于36 1 培養(yǎng)18 h24 h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴重時在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。 2）將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker 平板和血平板。血平板36 1 培養(yǎng)18 h24 h。Baird-Parker 平板36 1 培養(yǎng)18 h24 h 或45 h48 h。,13,.,2、增菌和分離培養(yǎng) 3）金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的

6、類似菌落；但無混濁帶及透明圈。,14,.,BP平板主要成分及作用：P223 氯化鋰、甘氨酸 抑制非制病性葡萄球的生長 丙酮酸鈉: 促進葡萄球菌生長 亞碲酸鉀: 抑制G-桿菌生長，可被金黃色葡萄球菌還原為碲鹽呈黑色 卵黃: 含蛋白質(zhì)、卵磷、脂肪,15,.,金黃色葡萄球菌 在BP平板上的菌落形態(tài) 圓形，光滑突起，濕潤，直徑2-3mm，顏色呈灰色到黑玉色，邊緣常為淡色（米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色），周圍為一混濁帶，在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹膠的粘稠感,16,.,2、增菌和分離培養(yǎng) 3）長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥

7、。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。,17,.,血平板上金黃色葡萄球菌 菌落形態(tài),金黃色葡萄球球菌的單個菌落在血平板上呈金黃色，有時也為白色，大而突出、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。,18,.,3、鑒定 1）染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為 0.5m1m。,19,.,2）血漿凝固酶試驗： 挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 個或以上，分別接種到5 mL BHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36 1 培養(yǎng)18 h24 h

8、。 取新鮮配置兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI 培養(yǎng)物0.2 mL0.3 mL，振蕩搖勻，置36 1 溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。,有無致病性的重要指標,20,.,2）血漿凝固酶試驗： 同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。 結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 1 培養(yǎng)18 h48 h，重復試驗。,有無致病性的重要指標,21,.,陽性,22,.,4、葡萄球菌腸毒素的檢驗

9、 可疑食物中毒樣品或產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定，應(yīng)按附錄B檢測葡萄球菌 腸毒素。 5、結(jié)果與報告 1）結(jié)果判定：符合2（3）、3，可判定為金黃色葡萄球菌。 2）結(jié)果報告：在25 g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。,23,.,金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測 一、動物學試驗主要用幼貓和猴。 二、血清學試驗 腸毒素作為抗原，可以和特異性抗體發(fā)生結(jié)合性反應(yīng)，產(chǎn)生可見沉淀。 方法主要有： 免疫瓊脂擴散法 反向間接血凝試驗 免疫熒光法 酶聯(lián)免疫吸附法,24,.,第二法 直接計數(shù)方法 1、樣品的稀釋 2、樣品的接種 3、培養(yǎng) 4、典型菌落計數(shù)和確認 5、結(jié)果計算與報告,25,.,1、

10、樣品的稀釋 同上 2、樣品的接種 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2 個3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10 倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接種量分別加入三塊Baird-Parker 平板，然后用無菌L 棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 50 的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。,26,.,3 培養(yǎng) 在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36 1 培養(yǎng)1 h；等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，3

11、6 1 培養(yǎng)，45 h48 h。,27,.,4 典型菌落計數(shù)和確認 1）金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。,28,.,4 典型菌落計數(shù)和確認 2）選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3 個平板所有菌落數(shù)合計在20 CFU200 CFU 之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。如果： a）只有一個稀釋度平板的

12、菌落數(shù)在20 CFU200 CFU之間且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落； b） 最低稀釋度平板的菌落數(shù)小于20 CFU 且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落； c） 某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；,29,.,4 典型菌落計數(shù)和確認 2）如果： d） 某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200 CFU 且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數(shù)不在20 CFU200 CFU 之間，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；以上按公式（1）計算。 e） 2 個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20 C

13、FU200 CFU 之間，按公式（2）計算。 3 ) 從典型菌落中任選5 個菌落（小于5 個全選），分別做血漿凝固酶試驗。,30,.,5 結(jié)果計算：,31,.,5 結(jié)果計算：,32,.,根據(jù)Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數(shù)，按5中公式計算，報告每g（mL）樣品中金 黃色葡萄球菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。,33,.,第三法 MPN計數(shù)方法 1、樣品的稀釋 2、接種培養(yǎng) 3、典型菌落確認 4、結(jié)果與報告,34,.,1、樣品的稀釋 同上 2、接種培養(yǎng) 1）根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇3 個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原

14、液），在進行10 倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液接種到10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯管，每個稀釋度接種3管，將上述接種物于36 1 培養(yǎng)45 h48 h。 2）用接種環(huán)從有細菌生長的各管中，移取1環(huán)，分別接種Baird-Parker平板，36 1 培養(yǎng)45 h48 h。,35,.,3 典型菌落確認 1）同上。 2）從典型菌落中至少挑取1 個菌落接種到BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂斜面，36 1 培養(yǎng)18 h24 h。 進行血漿凝固酶試驗 4 結(jié)果與報告 計算血漿凝固酶試驗陽性菌落對應(yīng)的管數(shù)，查MPN 檢索表（見附錄C），報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數(shù)，以MPN/g（mL）表示。,36,.,37,.,后面內(nèi)容直接刪除就行 資料可以編輯修改使用 資料可以編輯修改使用,38,.,主要經(jīng)營：網(wǎng)絡(luò)軟件設(shè)計、圖文設(shè)計制作、發(fā)布廣告等 公司秉著以優(yōu)質(zhì)的服務(wù)