1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,藥分教研室 丁曉紅,三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,（一）概述 1.內(nèi)毒素(Endotoxin)： 即革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖，其毒性成分為類脂A，菌體死亡崩解后釋放出來。 2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。 3.什么是鱟試劑？鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細(xì)胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能夠準(zhǔn)確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細(xì)菌內(nèi)毒素和（1,3）-葡聚糖激。,鱟的圖片,鱟的長相既像蝦又像蟹，人稱之為“馬蹄蟹”,是一

2、類與三葉蟲(現(xiàn)在只有化石)一樣古老的動物。,鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍(lán)色的。這種藍(lán)色血液的提取物“鱟試劑”，可以準(zhǔn)確、快速地檢測人體內(nèi)部組織是否因細(xì)菌感染而致?。辉谥扑幒褪称饭I(yè)中，可用它對毒素污染進(jìn)行監(jiān)測。,4.檢查方法：包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。 5.檢查的意義：注射劑熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是保證注射劑安全性的重要質(zhì)量指標(biāo)。,（二）凝膠法 1.原理：通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。(限量、陽性對照、靈敏度、溶劑、稀釋倍

3、數(shù)） 內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。 該法優(yōu)點：快速、靈敏。 2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查過程中用到的標(biāo)準(zhǔn)品和試劑 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）：系自大腸桿菌提取精制得到的內(nèi)毒素。用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度。,細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）：系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，確定其質(zhì)量的相當(dāng)效價。1ng工作標(biāo)準(zhǔn)品效價應(yīng)不小于2EU，不大于50EU。用于鱟試劑靈敏度的復(fù)核、干擾試驗及設(shè)置的各種陽性對照。 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）：系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查專用水。 鱟試劑和鱟試劑靈敏度：a、鱟試劑的生產(chǎn)：利用鱟

4、血制備而成。 鱟試劑的種類：美洲鱟試劑（LAL）、中國鱟試劑（TAL）、圓尾鱟試劑（CAL）。,B、鱟試劑的規(guī)格：是指每支鱟試劑的裝量，如：0.1ml、0.5ml。一般來說，規(guī)格是多少就用多少細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶。如：0.1ml就用0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶。 C、鱟試劑標(biāo)示靈敏度：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。 細(xì)菌內(nèi)毒素的限值（L）：哺乳動物對細(xì)菌內(nèi)毒素的量有一定的耐受力，只有內(nèi)毒素超過一定的限度，才會引起熱原反應(yīng)。因此內(nèi)毒素的檢查是一個限量檢查，只要不超過限值，產(chǎn)品就合格。確定限值的方法從質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文中

5、查出。,最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的測定。 MVD=CL/入。L：內(nèi)毒素限值；c：供試品溶液濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時，c=1.0ml/ml；當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時， c的單位為mg/ml或u/ml，如：供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD=1,例如：稱取mg供試品,Vml,移取注射液xml,Vml,MVD？,C最大有效,Lm/v=Lc樣入,c樣入/L,EU/mg,Lx/v=LMVD 入,MVD入/L,EU/ml,3.檢查方法 （1）檢查程序：實驗試劑、儀器及用具等的準(zhǔn)備；（除內(nèi)毒素） 確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒

6、素限值L； 選擇鱟試劑的靈敏度入； 計算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)或最低有效濃度； 鱟試劑靈敏度的復(fù)核； 藥品與鱟試劑的相容性的初選實驗（無干擾濃度初選）； 供試品的干擾實驗的驗證（正式干擾試驗）； 供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。 在實際操作過程中，（1）（4）順序可變，（5）（8）順序不能變。,(2)實驗準(zhǔn)備 A、除去干擾：試驗所用器皿需經(jīng)處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用的方法是250干烤至少1小時，也可用其它確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物的污染。 B、材料與器具：細(xì)菌內(nèi)

7、毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、漩渦混合器、371試管恒溫儀、稀釋、移液容器、試管架或試管浮板、酒精燈、消毒酒精棉球、剪刀、砂輪、鑷子、封口膠布標(biāo)記紙等。,(3)鱟試劑靈敏度的復(fù)核試驗 A、復(fù)核的條件：本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。,B、操作：,0.1ml/支規(guī)格鱟試劑原安瓿18支,復(fù)溶,0.1ml,內(nèi)毒素檢查用水,4支,4支,4支,4支,2支,2.0 內(nèi)毒素溶液,1.0 內(nèi)毒素溶液,0.5 內(nèi)毒素溶液,0.25 內(nèi)毒素溶

8、液,內(nèi)毒素檢查用水,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品或國家標(biāo)準(zhǔn)品,內(nèi)毒素檢查用水溶解15min,稀釋,371,保溫1h,呈陽性,呈陰性,結(jié)果有效,計算鱟試劑靈敏度,式中：X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。,當(dāng)c在0.52.0時，方可用于內(nèi)毒素檢查，并以C 為該批鱟試劑靈敏度,(4)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查-凝膠法-干擾試驗 按表制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。,干擾試驗結(jié)果判定,前提：A和D的所有平

9、行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。 按下列計算系列溶液C和B的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。 Es=lg-1（Xs/4) Et=lg-1（Xt/4) 式中 Es、Et分別為系列溶液C和溶液B反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。 當(dāng)Es在0.52(包括0.5 和2）及0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗。 注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。,（5）檢查方

10、法 取內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水稀釋至2入濃度溶液 取檢品S，計算MVD 把它稀釋成SMVD 取鱟試劑8支（0.1ml/支），2支作為樣品檢查管(S1、S2)，2支標(biāo)記為陽性對照，2支為陽性產(chǎn)品對照，2支標(biāo)記為陰性對照,舉例-清開靈注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查,設(shè)檢品為S，L=1.0EU/ml，選用效價為0.06EU/支、入=0.06EU/ml的鱟試劑，使用的細(xì)菌內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價為10 EU/支。參數(shù)及MVD已經(jīng)過預(yù)試驗驗證。 操作步驟（1）取內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水稀釋至2入濃度溶液，即E0.12. （2）計算最大稀釋倍數(shù)MVD=L/入=1.0/0.06=16倍 （3）取檢品S，把它稀釋呈SMVD：0.2mlS+3.0ml水 SMVD16,（4）取鱟試劑8支（0.1ml/支），兩支作為樣品檢查管(S1、S2)，2支標(biāo)記為陽性對照，2支為陽性產(chǎn)品對照，2支標(biāo)記為陰性對照，如下圖所示,（5）封閉管口，搖勻，放入3