1、第三篇 遺傳信息的傳遞,第十一章 核酸的生物合成,1、生物遺傳信息的中心法則（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等）。 2、DNA復(fù)制有關(guān)的酶以及各自作用，DNA的復(fù)制的特點(diǎn)以及復(fù)制的過程，掌握 3、DNA的損傷與修復(fù)。 4、RNA的生物合成（RNA聚合酶的組成、種類與性質(zhì)）。 5、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工。（尤其是各種RNA的加工）。 6、RNA指導(dǎo)下的RNA和DNA的生物合成（尤其是逆轉(zhuǎn)錄）。 7、比較DNA與RNA生物合成的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)。,要求掌握：,1、基因DNA大分子上的各個(gè)功能片段，有 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等功能。 2、分子生物學(xué)中心法則及其補(bǔ)充。,DNA,RNA,蛋白質(zhì),轉(zhuǎn) 錄,翻 譯,復(fù) 制,反 轉(zhuǎn) 錄,RN

2、A,翻 譯,蛋白質(zhì),復(fù) 制,3、基因表達(dá)通過轉(zhuǎn)錄和翻譯、用基因的遺傳信 息在細(xì)胞內(nèi)合成有功能意義的各種蛋白質(zhì)。 由于中心法則的建立，人們對核酸、蛋白質(zhì)的研究 更深入了，不僅研究它們的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用以 及它們之間一套復(fù)雜、精確的調(diào)控機(jī)制、調(diào)控基因的 表達(dá)與不表達(dá)；而且在體外可對DNA進(jìn)行改造，使遺 傳性狀改變或有目的地使基因表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)等基因 工程的應(yīng)用?，F(xiàn)今，人們把研究蛋白質(zhì)、核酸等生物 大分子的結(jié)構(gòu)、功能以及它們之間相互作用的科學(xué)劃 分為又一門新的學(xué)科，即分子生物學(xué)。,隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究，將來對中心 法則可能還會作出進(jìn)一步補(bǔ)充。如RNA在中心 法則中只是參與遺傳信息的表達(dá)，但

3、在補(bǔ)充法 則卻作為遺傳物質(zhì)；最近發(fā)現(xiàn)某些RNA分子具 有酶活性。最近，有學(xué)者提出：RNA不單是溝 通“DNA蛋白質(zhì)”之間的橋梁。RNA可能是功 能比DNA更廣泛的信息分子、可能是生命起源 過程中最早出現(xiàn)的生物大分子。,本篇依中心法則將介紹復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。同時(shí)介紹基因調(diào)控和基因工程這兩個(gè)在生命科學(xué)中處于理論和應(yīng)用的最前沿課程。,一、DNA復(fù)制方式 1、DNA復(fù)制模式半保留復(fù)制 （1）復(fù)制以親代DNA為模板，以四種dNTP 為原料，按堿基配對原則（A=T， GC） 合成子代DNA的過程。 （2）DNA復(fù)制的特點(diǎn)之一：半保留復(fù)制,第一節(jié) DNA的生物合成,半保留復(fù)制DNA復(fù)制時(shí)，親代DNA的兩條鏈

4、都作為模板，各自指導(dǎo)合成互補(bǔ)鏈，形成兩個(gè)與親代DNA完全一樣的子代分子，在每個(gè)子代DNA分子中均保留了一條親代DNA鏈，DNA這種復(fù)制方式被稱為半保留復(fù)制。,2、半不連續(xù)復(fù)制,(1)岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制 由于DNA雙鏈走向相反，而復(fù)制方向 為53，模板方向一定為35，故必有一股新鏈其模板解鏈方向與復(fù)制方向一致，可以連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈； 而另一股鏈其復(fù)制方向與解鏈方向相反，不能連續(xù)合成，稱為滯后鏈(或后隨鏈）。 不連續(xù)合成的后隨鏈的一個(gè)個(gè)片段稱為岡崎片段。后隨鏈的復(fù)制是由引物酶分段生成RNA引物，然后在各段引物的基礎(chǔ)上分段延長的。,原核生物總是從一個(gè)固定的起始點(diǎn)開始，在兩條模板上同時(shí)向兩個(gè)（

5、相反）方向進(jìn)行，稱雙向復(fù)制。,真核生物 雙向復(fù)制； 多點(diǎn)復(fù)制（有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，同時(shí)形成多個(gè)復(fù)制單位）。,單向復(fù)制模式和雙向復(fù)制模式,復(fù)制泡,二、復(fù)制點(diǎn)（DNA復(fù)制的起始點(diǎn)和方向）,三、DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶及相關(guān)蛋白因子 1）引發(fā)酶作用在模板的復(fù)制起始部位催化互補(bǔ)堿基的聚合，形成短片段RNA引物。其本質(zhì)為：RNA聚合酶（是一種不同于DDRP的RNA聚合酶）。 2）引發(fā)體為解鏈酶與其他復(fù)制因子結(jié)合辨認(rèn)起始點(diǎn)時(shí)再結(jié)合引物酶形成引發(fā)體。引發(fā)體解鏈酶+其它復(fù)制因子+引發(fā)酶 故引發(fā)體的作用是：辯認(rèn)起始點(diǎn)，結(jié)合在DNA模板上，解開DNA雙鏈，催化RNA引物形成。 3）引物為什么是RNA而不是DNA依賴于

6、DNA模板的DNA聚合酶簡稱DDDP ，不能催化兩個(gè)游離的dNTP聚合，而RNA聚合酶能催化兩個(gè)游離的NTP聚合。,1、RNA引物合成酶（引發(fā)酶）,2、 DNA聚合酶 催化53的聚合反應(yīng)：在引物上3-OH未端逐個(gè)加入dNMP（由dNTP去除PPi生成），使新鏈不斷延長。反應(yīng)需： 模板，按A=T，GC合成新鏈。 引物，引物3-OH和下一個(gè)dNMP在聚 合酶催化下生成3,5-磷酸二酯鍵，通過3,5-磷酸二酯鍵將單個(gè)核苷酸連 成長鏈。 合成方向53， 模板閱讀方向35。,3、DNA連接酶 1作用：連接DNA鏈3-OH未端和另 一DNA鏈的5-P未端，使二者生成磷酸 二酯鍵。如連接岡崎片段，DNA修復(fù)

7、、 重組、剪接中起缺口縫合等。 2注意：連接酶連接的都是堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上的雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨(dú)存在 的DNA或RNA單鏈作用。,4、解旋、解鏈酶類 解開“超螺旋”，解開并理順模板DNA雙鏈， 與SSB配合維持（模板部位）單鏈狀態(tài)。 解鏈酶： 作用：解開DNA雙鏈。解鏈酶有兩種，一是 rep蛋白（解鏈酶I），沿模板 35 移動。二是解鏈酶II，沿模板53移 動。,5、單鏈DNA結(jié)合蛋白（single stranded DNA-binding Protein，SSB或DBP）， 曾稱螺旋反穩(wěn)定蛋白（HDP） 作用： 與解開的單鏈DNA結(jié)合，維持復(fù)制時(shí)模 板處于單鏈狀態(tài)，防止復(fù)性。 對抗核酸

8、酶水解單鏈DNA，保護(hù)單鏈 完整性。 SSB可結(jié)合跨度為32個(gè)核苷酸單位，在DNA 解鏈中不斷結(jié)合，脫離再結(jié)合。,6、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（拓?fù)涿福?作用：松馳超螺旋，克服解鏈中出現(xiàn)的打結(jié)纏繞、 連環(huán)現(xiàn)象。 拓?fù)涿笍V泛存在于真核細(xì)胞及原核細(xì)胞，可分為兩型： 1I型拓?fù)涿福呵袛嚯p鏈DNA中的一段，待DNA松 弛后可將切口接上。不需ATP。 2II型拓?fù)涿福河须p重作用 水解作用切斷雙鏈DNA某部位，松弛超螺旋。 （不需ATP） 接合作用DNA松弛解纏后，連接斷口，并使 DNA進(jìn)入負(fù)螺旋狀態(tài)（右旋；“負(fù)” 比“正”有更好的模板作用）。 （消耗ATP）,DNA的復(fù)制過程,1、起始,1）辯認(rèn)起始部位：由解鏈

9、酶在DnaB起始蛋白協(xié)助下結(jié)合于復(fù)制起始點(diǎn)上。 2）解開DNA雙鏈：在起始點(diǎn)進(jìn)行，解鏈酶解開DNA雙鏈。需ATP（2ATP/bp）。 3）拓?fù)涿福ㄖ饕獮镮I型）松解超螺旋，防止由于解鏈出現(xiàn)的下游打結(jié)及纏繞現(xiàn)象。,4）SSB （單鏈DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合于開放的單鏈上，穩(wěn)定和保護(hù)單鏈作用 5）引發(fā)體中的引發(fā)酶按堿基配對規(guī)律合成RNA引物。（以DNA為模板按53方向合成。引物約含十幾幾十個(gè)堿基、有3-OH未端的RNA片段）。 6）pol III的亞單位辯認(rèn)引物。第一個(gè)脫氧核苷酸在該酶催化下加到引物3-OH未端上，形成磷酸二酯鍵。,復(fù)制叉形成,復(fù)制叉無論原核或真核細(xì)胞，復(fù)制開始由于DNA雙鏈解開，在兩

10、股單鏈上同時(shí)進(jìn)行復(fù)制，在電鏡下均看到伸展成叉狀的復(fù)制現(xiàn)象。在引物生成后，復(fù)制叉的形狀已基本具備。,復(fù)制的速度：細(xì)菌復(fù)制速度很快，2500bp/s，20分鐘可繁殖一代。真核生物復(fù)制速度慢些，但因其有多個(gè)復(fù)制始點(diǎn)，故總速度與原核差不多。,2、復(fù)制的延長 由DNA聚合酶（原核pol III；真核DNA聚合酶）催化dNTP以DNA為模板，按堿基配對原則逐個(gè)加到新鏈中，鏈得以延長，新鏈合成方向53。,復(fù)制的速度： 細(xì)菌復(fù)制速度很快，2500bp/s，20分鐘可繁殖一代。 真核生物復(fù)制速度慢些，但因其有多個(gè)復(fù)制始點(diǎn)，故總速度與原核差不多。,Eukaryotic真核生物 DNA replication,Pr

11、okaryote原核生物 DNA replication,（2）前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成 DNA雙鏈走向相反，模板方向?yàn)?5，而復(fù)制方向53。 1）前導(dǎo)鏈：一股新鏈其模板解鏈方向與復(fù)制方向一致，可以連續(xù)合成，稱為Leading strand 前導(dǎo)鏈； 2）滯后鏈：另一股鏈其復(fù)制方向與解鏈方向相反，不能連續(xù)合成，稱為Lagging strand 滯后鏈。,3、復(fù)制的終止 1）引物水解。由一種RNase將領(lǐng)頭鏈及岡崎片 段的引物水解除去。 2）修補(bǔ)空缺（引物水解后留下的空缺）。 由DNA聚合酶催化（原核pol I;真核DNA聚合酶）； 修補(bǔ)方向也是53。 3）連接。由DNA連接酶催化。 連接岡崎片段；

12、 連接領(lǐng)頭鏈的主體與引物空缺修補(bǔ)小片段。,1、原核細(xì)胞DNA的復(fù)制 （1）復(fù)制所需的條件（或稱“復(fù)制體系”）： 1）底物：d NTP 2）聚合酶：DNA聚合酶 3）模板：模板DNA的雙鏈（即解開為單鏈狀態(tài)的兩 條DNA母鏈） 4）引物： DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離的dNTP互相聚合，需一引物。引物即為小分子RNA（含3-OH的寡核苷酸）。 5）其他酶和蛋白質(zhì)因子。如解旋酶、解鏈酶、DNA 連接酶等。,三、原核生物中DNA的復(fù)制,（2）原核生物的DNA聚合酶為三種： pol I pol II pol III 含量 最多 最少 活性 見課本 見課本 見課本 功用 校讀、修復(fù) 復(fù)制 復(fù)制最主要的酶

13、 填補(bǔ)空缺 核酸外切酶活性 53 + + 35 + + +, 核酸外切酶活性。 153外切酶活性：從5端把核苷 酸從核酸鏈上水解下來，pol I、III具有。 235外切酶活性：從3端把核苷 酸從核酸鏈上水解下來，pol I、II、III 均具有。,核酸外切酶活性的作用是： 即時(shí)校讀DNA復(fù)制出現(xiàn)堿基配對錯(cuò)誤 時(shí)，DNA聚合酶利用外切酶活性（主要 為35外切酶）清除錯(cuò)配堿基，并利 用53聚合酶活性補(bǔ)回正確配對堿基， 這種功能稱之。主要由pol I完成。 切除引物、切除突變的片段均為pol I 53外切酶的作用。, 復(fù)制的保真性（fidelity） 1、概念DNA復(fù)制時(shí)DNA聚合酶依賴模 板，保

14、證遺傳信息傳代延續(xù)中子鏈與母鏈 配對準(zhǔn)確無誤，稱之。 2、保真機(jī)理 1遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律。聚合時(shí)，磷 酸二酯鍵的形成應(yīng)在氫鍵的準(zhǔn)確搭配之 后發(fā)生。 2聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能。 如母鏈為T，酶能選擇A而不是其他。 3復(fù)制中出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)校讀功能（有錯(cuò)即改）。,原核生物DNA的復(fù)制過程：,辯認(rèn)起始部位：由解鏈酶在識別蛋白協(xié)助下結(jié)合于復(fù)制起始點(diǎn)上。 解開DNA雙鏈：在起始點(diǎn)進(jìn)行。 解鏈酶解開DNA雙鏈。需ATP解開雙鏈并非解鏈酶單獨(dú)作用（2ATP/bp） ，可能構(gòu)成引發(fā)體后再進(jìn)行解鏈。 DNA旋轉(zhuǎn)酶或拓?fù)涿福ㄖ饕獮镮I型）松解超螺旋，防止由 于解鏈出現(xiàn)的下游打結(jié)及纏繞現(xiàn)象。,單鏈結(jié)合蛋

15、白SSB結(jié)合于開放的單鏈上，穩(wěn)定和保護(hù)單鏈作用 引發(fā)體中的引發(fā)酶按堿基配對規(guī)律合成RNA引物。以DNA為模板按53方向合成。引物約含十幾幾十個(gè)堿基、有3-OH未端。 pol III的亞單位辯認(rèn)引物。第一個(gè)脫氧核 苷酸在該酶催化下加到引物3-OH未端上，形成磷酸二酯鍵。,四、真核生物中的DNA復(fù)制,真核生物的DNA聚合酶為五種：,1）DNA 聚合酶 and 主要復(fù)制 染色體DNA, DNA 聚合酶 主要為滯后鏈的合成； DNA 聚合酶 主要為前導(dǎo)鏈的合成 2）DNA聚合酶 and 主要為修復(fù) DNA, 3）DNA 聚合酶 主要線粒體 DNA復(fù)制和修復(fù).,端粒與端粒酶,端粒：是真核細(xì)胞染色體末端一

16、種膨大的、DNA富含GC重復(fù)序列的粒體結(jié)構(gòu)。,端粒酶：是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的能催化DNA合成的酶。這種合成以本身的RNA為模板。,模板 AGGGTTAC,新鏈 5,CCCAAUG (RNA片斷) 端粒酶,端粒,DNA polymerase,3）在真核細(xì)胞，DNA復(fù)制的同時(shí)，各種染色體蛋白（組蛋白及非組蛋白）同時(shí)合成。一但DNA復(fù)制結(jié)束，即可裝配為核蛋白并組成染色體。,五、 反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)的DNA合成）,DNA RNA,轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄,RNA,轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄主要從病毒中發(fā)現(xiàn)RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、其催化底物為d NTP，催化生成與RNA（作為模板）堿基序列互補(bǔ)的DNA ；遺傳信息從R

17、NA流向DNA。,一DNA突變 突變的概念：由于理化因素使DNA組成改變，即DNA分子上的堿基改變，如未能完全修復(fù)而引起可遺傳的變異稱之。又稱基因突變。 突變的原因有：自發(fā)突變和誘變：自發(fā)突變即遺傳過程“自發(fā)”地發(fā)生；誘變即用人工手段（理化因素：如紫外線、離子輻射、羥胺、亞硝酸鹽、氮芥類等。），使DNA發(fā)生突變。,第二節(jié) DNA的損傷與修復(fù),（二突變的結(jié)果 包括： 致死性； 生物體內(nèi)某些功能喪失； 只改變基因而對表現(xiàn)型無影響； 產(chǎn)生了利于物種生存或有利于人類的結(jié)果。,三突變的類型： 1、點(diǎn)突變：DNA分子上一個(gè)堿基的變異。又分為轉(zhuǎn)換 和顛換：轉(zhuǎn)換即同型堿基的轉(zhuǎn)換；顛換即異型堿基 （嘌呤與嘧啶）

18、的轉(zhuǎn)換。 2、缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA上消失。 3、插入:一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到另一個(gè)DNA 分子上，缺失和插入均引起移碼突變（轉(zhuǎn)錄后密碼 子改變）。 4、倒位：DNA鏈內(nèi)部重組。其中一段方向反置，如從 53變?yōu)?5或一大段DNA分子在DNA分 子內(nèi)遷移。,GAAGTAGCT GAGGTAGCT為點(diǎn)轉(zhuǎn)換突變,GACCTAGCT GACTTAGCT為 為點(diǎn)顛換突變,GACGTAGCT GATAGCT為 為缺失突變,GACGTAGCT GACGCATAGCT為插入突變,GACGTAGCT GACGATGCT為倒位突變,復(fù)制過程中發(fā)生DNA突變稱為DNA損傷， 大多屬于自發(fā)突變。體

19、內(nèi)靠校讀和修復(fù)機(jī)制消 除已發(fā)生的缺陷。 1、校讀： 核內(nèi)pol I有核酸外切酶活性，隨時(shí)把錯(cuò)誤配 對的核苷酸切除，并利用其DNA聚合酶活性補(bǔ) 回正確的核苷酸。這種由pol I監(jiān)視和糾正復(fù)制 錯(cuò)誤的功能稱校讀。,二、損傷的修復(fù),2、修復(fù)： 如錯(cuò)誤配對屢屢發(fā)生或涉及范圍大，則需 一些機(jī)制來修復(fù)，包括： （1）、光修復(fù)：需光能激活的修復(fù)酶修復(fù)。如該 酶可使因紫外線照射而形成的二聚體T T分解為原來的單體狀態(tài)。 （2）、切除修復(fù)：需特異核酸內(nèi)切酶、pol I、DNA連接酶的共同作用。 這是人類DNA損傷的主要修復(fù)方式。,3、重組修復(fù)：適于損傷面積較大時(shí)。 4、SOS修復(fù)：緊急修復(fù)，出現(xiàn)的錯(cuò)誤多且廣泛。

20、由于修復(fù)不完全，可引起較長期廣泛的突變。,轉(zhuǎn)錄（DNA指導(dǎo)下的RNA合成）,1、轉(zhuǎn)錄生物體以DNA為模板，按堿基互補(bǔ)規(guī)律合成RNA的過程。把DNA的堿基序列抄錄成RNA 的堿基序列。,2、轉(zhuǎn)錄所需的條件： 1原料：NTP 2模板：DNA雙鏈中的一股 3酶：RNA聚合酶，全稱為“依賴DNA的RNA聚合酶”（DNA-dependent RNA polymerase DDRP），也稱轉(zhuǎn)錄酶。,第三節(jié) RNA的生物合成,一、概述,一原核生物的RNA聚合酶（以E.coli的酶研 究比較透徹） 1、該酶由5個(gè)亞基組成：即2，其 中亞基易脫落。 2、核心酶：即2，具有催化聚合功能， 不能辯認(rèn)起始點(diǎn)，但參與轉(zhuǎn)

21、錄的延長。,一、RNA聚合酶,3、全酶；即2，既辯認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)， 又有催化聚合功能，參與轉(zhuǎn)錄起始。 4、各亞基的功能： 亞基決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄 亞基與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān) 亞基結(jié)合DNA模板 亞基辯認(rèn)起始點(diǎn)。亞基本身并無催化功能;它的作用是識別DNA分子上的起始信號。,有三種類型：RNA pol I、RNA pol II、RNA pol III。 RNA pol I 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為rRNA的前體（45S-rRNA）； RNA pol II 轉(zhuǎn)錄mRNAD的前體（hnRNA）； RNA pol III 轉(zhuǎn)錄5S-rRNA，tRNA，snRNA（核RNA)前體。 由于hnRNA為mRNA前體，而mRNA在各

22、種RNA中壽命最短，最不穩(wěn)定，需經(jīng)常合成，故酶II被認(rèn)為是最重要的酶。,（二）真核RNA 聚合酶,1、啟動子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也就是使轉(zhuǎn)錄開始的部位。在基因表達(dá)的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄的起始是個(gè)關(guān)鍵。常常某個(gè)基因是否應(yīng)當(dāng)表達(dá)決定于在特定的啟動子起始過程。,2、啟動子處的核苷酸順序具有特異的形狀以便與RNA聚合酶結(jié)合。 3、在RNA合成開始位點(diǎn)的上游大約10bp和35bp處有兩個(gè)共同的順序，稱為-10和-35序列。 這兩個(gè)序列的共同順序如下：-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”； -10區(qū)“TTGACATATATT”。大多數(shù)啟動子均有共同順序只有少數(shù)幾個(gè)核苷酸的差別。 4、啟動

23、子中的10和-35序列是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序。,二、啟動子,三、終止子,-10序列又稱為Pribnow盒(原核生物)。在真核生物中相應(yīng)的序列位于-35bp處，稱為TATA盒，又稱為Goldberg-Hognessbox，是RNA聚合酶的結(jié)合部位。,五、轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的異同 相同：模板：DNA 原料：三磷酸核苷酸 遵守堿基配對規(guī)律 模板閱讀方向：35； 新鏈合成方向：53 酶：依賴DNA的聚合酶 產(chǎn)物：多核苷酸鏈,不同： 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 模板 DNA雙鏈 DNA模板鏈 原料 dNTP NTP 配對 AT，GC AU，TA， GC 酶 DDDP DDRP 產(chǎn)物 子代DNA（半保留） RNA（

24、mRNA tRNA 、 rRNA等） 引物 小段RNA 不需要引物,可分為起始、延長、終止三個(gè)階段 1、轉(zhuǎn)錄過程以DDRP全酶辯認(rèn)并結(jié)合DNA模板而開始。 2、隨著酶的向前移動（5），轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA 不斷延長。 3、當(dāng)轉(zhuǎn)錄酶到達(dá)終止信號處，酶與DNA模板分離、 產(chǎn)物RNA脫落、轉(zhuǎn)錄即告結(jié)束。 4、真核生物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還需有“轉(zhuǎn)錄后加工”的過程。,三、RNA的轉(zhuǎn)錄過程,1、RNA聚合酶全酶辨認(rèn)、結(jié)合到模板的啟 動區(qū)在真核細(xì)胞還有一些特異調(diào)控DNA稱順式 調(diào)控元件，還有一些辯認(rèn)DNA的蛋白質(zhì)稱反式 調(diào)控因子共同參與轉(zhuǎn)錄起始過程。,（一）轉(zhuǎn)錄的起始,2、解開DNA雙鏈，形成“轉(zhuǎn)錄空泡”。 1）較早認(rèn)為

25、RNA聚合酶與DNA結(jié)合后，“擠 入”雙螺旋結(jié)構(gòu)之內(nèi)，使DNA解鏈，不需 其他輔助因子。 目前認(rèn)為拓?fù)涿窱I也參與作用，形成負(fù)超螺 旋，有利于轉(zhuǎn)錄。 2）解鏈的范圍不大（1020bp）形成轉(zhuǎn) 錄空泡。,3、起動復(fù)合物形成，轉(zhuǎn)錄開始： 不需引物，RNA聚合酶在起始部位催化兩 個(gè)核苷酸形成磷酸二酯鍵。第一個(gè)核苷酸 常為GTP，GTP與隨后的NTP生成 PPPGPN-OH，仍保留三磷酸鳥苷狀態(tài)。 因此常把RNA聚合酶全酶-DNA-PPPGPN -OH稱為轉(zhuǎn)錄的起始復(fù)合物。 4、因子從全酶脫落，可重復(fù)利用。,1、核心酶沿著模板滑動，催化四種NTP按堿基配對原則生成長的核苷酸鏈，方向53。核心酶經(jīng)過后，

26、DNA雙鏈復(fù)合為雙螺旋，RNA鏈與模板分離。 2、因同一DNA上可多位點(diǎn)同時(shí)轉(zhuǎn)錄；又因DNA DNA較DNARNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，故RNA易被排斥分離，在電鏡下，同一DNA模板上，長短不一的RNA鏈散開成羽毛狀圖形。,3、同時(shí)將轉(zhuǎn)錄過程形成的“酶-DNA-RNA”復(fù)合物稱為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。 4、對于較長的mRNA，可一邊轉(zhuǎn)錄、一 邊與核糖體結(jié)合而開始“翻譯”過程。,（二）轉(zhuǎn)錄的延長,DDRP（核心酶）在模板的“轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)”停頓，酶模板分離， RNA脫落。 1、依賴因子幫助： 因子幫助RNA聚合酶辯認(rèn)終點(diǎn)并停止轉(zhuǎn)錄。因子與RNA結(jié)合（主要與PolyC親和力最大）RNA-DNA雜化雙鏈的短鏈變性利于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

27、從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放。因子有ATP酶與解鏈酶活性。,2、不依賴因子 RNA產(chǎn)物形成特殊結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。在近轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物常出現(xiàn)多個(gè)“UUUU.”結(jié) 構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)之前，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成“發(fā)夾樣”或“柄鼓泡”樣結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)是阻止轉(zhuǎn)錄繼續(xù)向下游推進(jìn)的關(guān)鍵。,（三）轉(zhuǎn)錄終止,四、轉(zhuǎn)錄過程的抑制劑,無論原核或真核生物，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都經(jīng)過一定程度的修飾和加工才表現(xiàn)功能。 真核生物轉(zhuǎn)錄后加工修飾更復(fù)雜，故主要介紹真核生物。,（一）mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 1、首尾修飾 （1）5端帶帽：即GPPPmG。其功能：一 種翻譯起始因子可和帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合，故與翻譯過程有關(guān)。 （2）3端接尾；即PolyA，一般1002

28、00bp。 其功能：維持mRNA作為翻譯模板活性， 增加mRNA穩(wěn)定性。,五、轉(zhuǎn)錄后的加工,2、內(nèi)部剪接 （1）斷裂基因（Split gene）、外顯子（exon）和內(nèi)含子（intron） a斷裂基因真核生物的結(jié)構(gòu)基因常由若干 個(gè)編碼區(qū)及非編碼區(qū)間隔連續(xù)鑲嵌而成，稱之 b外顯子基因中（包括hnRNA）能編碼AA的片段。 c內(nèi)含子基因中（包括hnRNA）非編碼AA 的片段。 原核生物結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)的編碼序列，無斷裂 基因。,（2）mRNA的剪接：即剪去內(nèi)含子，拼接外顯子斷裂基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成hnRNA，hnRNA剪去內(nèi)含子，拼接外顯子，成為成熟的mRNA,（二）tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 tRNA為DDR

29、PIII的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1、剪接：去除插入的堿基。 2、生成各種稀有堿基：即除A、C、G、U以外的 堿基，如DHU、I等。 1甲基化：AAm, GGm 2還原反應(yīng)：UDHU 3核苷內(nèi)轉(zhuǎn)位反應(yīng)：尿嘧啶核苷假尿苷（C5C1） 4脫NH3：AI 3、3端加入CCA-OH未端，完成氨基酸臂的,（三）rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 rRNA的基因（rDNA）屬豐富基因族的DNA序列，有高度重復(fù)序列，這些序列可被不能轉(zhuǎn)錄為mRNA的間隔區(qū)分隔組成。 一rRNA的加工： rRNA在胞核內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成45S-rRNA，后者經(jīng)加工剪接形成18S-rRNA和經(jīng)拼接形成5.8s及28s-rRNA。三種rRNA一起和核糖體蛋白構(gòu)成核

30、糖體，進(jìn)入胞質(zhì)。,二rRNA的自我剪接與ribozyme(核酶) 研究發(fā)現(xiàn)一些低等真核生物細(xì)胞核的rRNA，其剪接不需任何蛋白質(zhì)參與，故認(rèn)為RNA分子具有酶的活性，從而提出核酶的概念。 1、核酶（ribozyme）：具有催化作用的RNA。主要參與RNA的自我剪接過程 2、核酶二級結(jié)構(gòu)槌頭狀結(jié)構(gòu)，包括有底物部位（含G、U序列）和催化部位（有三個(gè)莖及1或2個(gè)環(huán)）。,一、概念： 基因工程是在體外將分離純化或人工合成的DNA與載體DNA結(jié)合，成為重組DNA，用以轉(zhuǎn)化宿主（細(xì)菌或其他細(xì)胞），然后篩選出能表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、傳代、擴(kuò)增，成為克隆的技術(shù)。因此基因工程也稱為基因克隆或重組DNA技

31、術(shù)。 克隆(Clone)親代細(xì)胞通過無性繁殖而產(chǎn)生一組單一細(xì)胞的過程稱之?？寺∫脖硎緩膯我挥H代細(xì)胞通過無性繁殖而產(chǎn)生的一組單一的細(xì)胞。,第二節(jié) 基因工程操作技術(shù),給體DNA片段,給體DNA,重組質(zhì)粒,染色體DNA,細(xì)菌,細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與含重組質(zhì)粒的細(xì)菌的篩出,已轉(zhuǎn)化的細(xì)菌,細(xì)菌繁殖,含該重組質(zhì)粒的細(xì)菌克隆株,基因工程技術(shù)示意圖,一分載體和目的基因的分離 1、常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、M13噬菌體等。 此外還有逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA、昆蟲病毒DNA。 對載體的要求： 1能獨(dú)立復(fù)制，但需宿主的酶體系進(jìn)行基因表達(dá)。 2有篩選標(biāo)記：如抗藥性基因。 3分子量不大，盡可能有多種內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)。 4可通過破碎細(xì)菌，用

32、密度梯度離心法分離。 （5）容易進(jìn)入受體細(xì)胞,二、基因工程的五大步驟（分、切、接、轉(zhuǎn)、篩）,EcoRI 0,HindIII 29,BamHI 375,SalI 650,AvaI 1425,PvuII 2066,PstI 3609,耐氨芐青霉素基因,耐四環(huán)素基因,2、目的基因的來源： 1直接從染色體DNA分離，多用于原核生物。 2人工合成。 3從mRNA合成cDNA，需反轉(zhuǎn)錄酶。,4基因文庫：是含有某種生物體全部基因的 隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。包括 G文庫（總DNA文庫）、 C文庫（cDNA文庫）。 基因文庫制備過程：全部DNA分離提純，經(jīng)過 酶切形成DNA片段，重組入同一個(gè)載體，成為重 組體，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌保存起來。,基因文庫包括： （1）G文庫用基因組的總DNA來制備的 稱之。 （2）C文庫用細(xì)胞全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄 生成cDNA，以之來建庫。 應(yīng)用“探針”可把目的基因釣出。,二切限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 1、作用識別核酸分子某些堿基序列并 加以切開。不同的限制酶其酶切點(diǎn)不同。 酶辯認(rèn)的堿基序列一般為46個(gè)，而且這 些堿基序列大多有回文結(jié)構(gòu)。 2、回文結(jié)構(gòu)即堿基排列順序在順讀和反 讀都是一樣的。,3、酶作用的切口 （1）平端切口同一水平上切斷DNA兩股鏈。 （2）粘端切口兩鏈切口錯(cuò)開24個(gè)核苷酸 如為四核苷酸切