1、青霉素的制備,1,（A）、理化性質(zhì)： 1、溶解性：受pH影響 游離酸：易溶于有機溶劑，難溶于水 鹽：易溶于水，幾乎不溶于有機溶劑，當(dāng)有機溶劑中含少量水時，溶解度增大。 2、酸堿性：有機弱酸,2,3、穩(wěn)定性：干燥純凈的鹽固體穩(wěn)定；純有機溶劑溶液穩(wěn)定；遇酸堿易分解；-內(nèi)酰胺環(huán)易為親核或親電試劑作用而打開失活；青霉素的水溶液不穩(wěn)定。 溫度、pH對其穩(wěn)定性的影響,-,3,4降解反應(yīng),4,5、聚合反應(yīng) 氨芐青霉素在水溶液中易形成聚合物，是氨芐青霉素過敏反應(yīng)的主要過敏原之一。,5,6、過敏反應(yīng) 可能為青霉噻唑多肽和青霉噻唑蛋白,6,（B）、制備工藝,1、菌種 最早的原始菌種是點青霉菌(Penicilliu

2、m notatum)； 現(xiàn)用產(chǎn)黃青霉菌(Pen.chrysogenum) 按菌絲的形態(tài)分為絲狀菌（黃孢子和綠孢子）和球狀菌（綠孢子和白孢子）兩種。 國內(nèi)青霉素生產(chǎn)廠大都采用綠色絲狀菌，有的廠家用白孢子球狀菌。,7,2、發(fā)酵工藝流程,1）絲狀菌發(fā)酵工藝流程,大米茄子瓶,8,2）球狀菌培養(yǎng)工藝流程 球狀菌菌種 親米孢子 生產(chǎn)米孢子 種子液 發(fā)酵液,（親米孢子培養(yǎng)） 親米錐形瓶,25度，6-8d,冷凍管,（生產(chǎn)米孢子培養(yǎng)） 大米茄子瓶,25度，8-10d,種子罐培養(yǎng) 種子罐,28度，50-60h，1.5v/(v*min),發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐,26度，PH6.7-7.0，6-7d，0.8-1.0v/(

3、v*min),9,3、發(fā)酵工藝要點,1）絲狀菌：種子：砂土孢子接入斜面上，25培養(yǎng)67天，制成懸液，接入大米茄子瓶內(nèi)，經(jīng)25培養(yǎng)67天，制成大米孢子，真空干燥。 生產(chǎn)時按接種量移入種子罐（葡萄糖、玉米漿、尿素），25培養(yǎng)4045小時，菌絲濃度達40%以上，按10%-15%接種量移入繁殖罐（花生餅粉、葡萄糖）內(nèi)。 經(jīng)25培養(yǎng)1315小時，菌絲體積40%以上，殘?zhí)窃?.0%左右，無菌檢查合格便可作為種子，按30%接種量移入發(fā)酵罐。,10,2）球狀菌：首先由冷凍管孢子接入混合有0.5-1.0%玉米漿的搖瓶培養(yǎng)原始親米孢子，再接入大米茄子瓶生產(chǎn)大米孢子，兩者都是在25度下靜置培養(yǎng)10天可收獲。保存在5

4、度冰箱。種子培養(yǎng)：冷藏10天以內(nèi)的生產(chǎn)米，接入種子罐（花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖）28度培養(yǎng)50-60h，當(dāng)PH降為5.5-5.0，菌絲呈菊花團狀，平均直徑在100-130微米，每毫升球菌數(shù)6萬-8萬只，沉降率在85%以上，可用。接入發(fā)酵罐。,11,培養(yǎng)基,碳源： 提供能量 如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。乳糖能被產(chǎn)生菌緩慢利用而維持青霉素分泌的有利條件，故為最佳碳源，但價格高，普遍使用有困難。天然油脂如玉米油、豆油也能被緩慢利用作為有效的碳源，但不可能大規(guī)模使用。目前生產(chǎn)上用的碳源是葡萄糖母液和工業(yè)用葡萄糖。 絲狀菌補糖一般在殘?zhí)墙抵?.6%左右、PH上升后開始加，0.07-

5、0.15%/次，次/h;球狀菌在PH高于6.5時開始加糖。,12,氮源： 提供蛋白合成原料 玉米漿?，F(xiàn)因國內(nèi)玉米漿產(chǎn)量少，經(jīng)調(diào)整配方以花生餅粉代替，生產(chǎn)水平也可達到技術(shù)指標(biāo)。目前生產(chǎn)上用的氮源是花生餅粉、麩質(zhì)粉玉米胚芽粉及尿素等。,13,前體 作為芐青霉素生物合成的前體有苯乙酸、苯乙酰胺等。它們一部分能直接結(jié)合到青霉素分子中。這些前體對青霉菌都有一定的毒性，加入量不能大于0.1%。加入硫代硫酸鈉能減少它們的毒性。,14,無機鹽 硫和磷:硫濃度降低時青霉素產(chǎn)量減少3倍，磷濃度降低時青霉素產(chǎn)量減少1倍。 鈣、鎂和鉀： 青霉素的生物合成中合適的陽離子比例以鉀30%、鈣20%、鎂41%為宜。如鎂離子少

6、，鉀離子多時，菌絲細胞將培養(yǎng)基中氮源轉(zhuǎn)化成各種氨基酸的能力強。鈣離子影響細胞的生長和培養(yǎng)基的pH 。 鐵離子：鐵易滲入菌絲內(nèi)，它對青霉素發(fā)酵有毒害作用。發(fā)酵液中鐵含量6微克/毫升時無影響；60微克/毫升時降低產(chǎn)量30%；300微克/毫升時降低產(chǎn)量90%。要低于30微克/ml,15,培養(yǎng)條件控制,產(chǎn)黃青霉菌分三個不同代謝時期。 菌絲生長繁殖期:發(fā)芽、菌絲增殖、形成脂粒、積累藏物。 青霉素分泌期: 菌絲生長趨勢減弱，間隙添加葡萄糖作碳源和間隙加入花生餅粉、尿素作氮源，并間隙加入前體，此期間球狀菌pH要求6.66.9，絲狀菌pH要求6.26.4， 青霉素分泌旺盛。 菌絲自溶期:,16,控制要點： 1

7、）加糖控制：一般殘?zhí)墙抵?.6%左右、pH上升后可開始加糖。 2）補料及添加前體：絲狀菌發(fā)酵于接種后812小時，發(fā)酵液中殘余苯乙酰胺濃度為0.050.08%。球狀菌在發(fā)酵10h后加入尿素、氨水和苯乙酸的混合料，每3h加入一次，加入量視生長狀況。 3）pH控制：主要通過加葡萄糖控制pH，在PH大于6.5時可以加入硫酸銨 4）溫度控制：青霉菌生長最適溫度（27度）高于青霉素分泌的最適溫度（20度）。種子罐培養(yǎng)絲狀和球狀菌菌要求25，發(fā)酵罐培養(yǎng)絲狀菌要求26-24-23-22、球狀菌要求26-25-24，前期罐溫高于后期。,17,5）通氣與攪拌 深層培養(yǎng)需通入一定量空氣，并不停地攪拌以保證溶氧的濃度

8、。試驗證明，通氣量0.8-1.0v/v*min.中、后期減慢轉(zhuǎn)速對球狀菌的生理生化代謝有利，它能提高發(fā)酵單位，并能節(jié)約能源。 6）泡沫與消沫 用化學(xué)合成消沫劑“泡敵”等,18,4、提煉工藝流程,工業(yè)鉀鹽生產(chǎn)工藝流程,p581,19,1.工業(yè)鉀鹽生產(chǎn)工藝流程,發(fā)酵液 一次濾液和其余發(fā)酵液 二次濾液 一次丁酯萃取液 緩沖液萃取液 二次丁酯萃取液 脫色脫水液 結(jié)晶液 青霉素鉀濕結(jié)晶體 洗滌后濕晶體 過篩顆粒 干燥粉末 青霉素鉀成品,（鼓式真空過濾） 1/3-1/2發(fā)酵液,10度以下,（板框過濾） 10%硫酸，0.07%PPB,0.7%硅藻土，28%水,PH4.5-5.0，10度以下,（一次丁酯萃?。?/p>

9、 10%硫酸，1/3體積醋酸丁酯，0.1%PPB,PH1.8-2.2，10度以下,（緩沖液萃?。?1.6%碳酸氫鈉,PH6.8-7.4，10度以下,二次丁酯萃取，硫酸，丁酯 PH1.8-2.2，10度以下,脫色脫水過濾 活性炭,-10度以下,無菌過濾,結(jié)晶，過濾 醋酸鉀乙醇溶液,10-20度,洗滌 丁醇，醋酸乙酯,過篩，制粒,真空干燥 90-95度，20mmHg,8-10h,涼粉 40度左右,20,2.青霉素鈉鹽制備（共沸蒸餾結(jié)晶）,發(fā)酵液 二次丁酯萃取液 脫色二次丁酯萃取液 青霉素鈉鹽水萃取液 結(jié)晶液 青霉素鈉鹽濕結(jié)晶 洗后濕結(jié)晶 干燥粉末 青霉素鈉鹽成品,過濾，一次丁酯萃取，緩沖液萃取，二

10、次丁酯萃取,與制青霉素鉀鹽相同,脫色過濾 活性炭,水萃取， 0.5molNaOH溶液，10度以下,共沸蒸餾 2.5倍體積丁醇,PH6.4-6.8，16-26度，5-10mmHg,過濾,洗滌分離 丁醇，乙酸乙酯,真空干燥 90-95度，10mmHg,8-10h,涼粉 40度左右,21,5、提煉工藝要點,1）發(fā)酵液預(yù)處理和過濾 放罐后，首先要冷卻 目前采用鼓式過濾及板框過濾，加助濾劑。酸化時pH應(yīng)控制得高些(pH45)，再加些絮凝劑如十五烷基溴代吡啶(PPB)等, 過濾。 隨著高效高速萃取離心機的出現(xiàn)，如德國Westfalia公司出品的傾析器(decantor) ，可革去過濾工序，比用板框過濾除去

11、菌絲后再提取的收率高出23%。,22,2）影響青霉素提取的主要因素 青霉素提取效果除了已選定適當(dāng)?shù)挠袡C溶媒，破乳化劑和離心分離設(shè)備外，還與下列主要因素有關(guān): pH值 一般從濾液萃取到醋酸丁酯時，pH選擇2.02.5，而從丁酯反萃取到水相時，pH選擇6.87.2之間。 溫度 要求提取在低溫(10以下)條件下進行較為有利。在設(shè)備上要考慮用冷鹽水進行冷卻，以降低溫度，特別是酸化崗位，溫度要求更低些。,23,時間 酸化時速度應(yīng)快些。堿化時速度可放慢些，因青霉素在中性下半衰期要長些，破壞要緩和些，故以能分離得清為原則。 萃取方式和濃縮比 萃取劑和萃取方式選擇 目前生產(chǎn)上采用二級逆流萃取方式。濃縮比的選擇也很重要，因為丁酯的用量與收率和質(zhì)量都有關(guān)系。丁酯用量為濾液體積的2530% 時，色素相對含量低，濃縮比為1.52.5倍。,24,3）精制 脫色脫水：活性碳脫色；冰凍脫水法，用冷鹽水降溫至-18- -20度，水結(jié)冰析出。 青霉素鉀鹽結(jié)晶：青霉素丁酯二次提取液中，加入醋酸鉀乙醇溶液，青霉素