中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB5009.204—2014

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品中丙烯酰胺的測(cè)定

2014-12-01發(fā)布2015-05-01實(shí)施

GB5009.204—2014

I

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T5009.204－2005《食品中丙烯酰胺含量的測(cè)定方法氣相色譜一質(zhì)譜（GC-MS）法》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T5009.204－2005相比，主要變化如下：

——增加第一法穩(wěn)定性同位素稀釋的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法；

——?dú)庀嗌V-質(zhì)譜法將外標(biāo)法改為穩(wěn)定性同位素稀釋法。

GB5009.204—2014

1

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品中丙烯酰胺的測(cè)定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中丙烯酰胺的測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于熱加工（如煎、炙烤、焙烤等）食品中丙烯酰胺的測(cè)定。

第一法穩(wěn)定性同位素稀釋的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

2原理

本標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)，在試樣中加入

13C

3標(biāo)記的丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液，以水為提取溶劑，

經(jīng)過(guò)固相萃取柱或基質(zhì)固相分散萃取凈化后，以液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)或選擇反

應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。

3試劑和材料

注：除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1試劑

3.1.1甲酸(HCOOH)：色譜純。

3.1.2甲醇(CH3OH)：色譜純。

3.1.3正己烷(n-C6H14)：分析純，重蒸后使用。

3.1.4乙酸乙酯(CH3COOC2H5)：分析純，重蒸后使用。

3.1.5無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4)：400℃，烘烤4h。

3.1.6硫酸銨[(NH4)2SO4]。

3.1.7硅藻土：ExtrelutTM20或相當(dāng)產(chǎn)品。

3.2標(biāo)準(zhǔn)品

3.2.1丙烯酰胺(CH2=CHCONH2)標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%）。

3.2.2

13C

3-丙烯酰胺（

13CH2=13CH13CONH

2）標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%）。

3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

3.3.1丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

3.3.1.1丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1000mg/L）：準(zhǔn)確稱取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，使丙

烯酰胺濃度為1000mg/L，置﹣20℃冰箱中保存。

3.3.1.2丙烯酰胺中間溶液（100mg/L）：移取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1mL，加甲醇稀釋至10mL，使

丙烯酰胺濃度為100mg/L，置﹣20℃冰箱中保存。

3.3.1.3丙烯酰胺工作溶液Ⅰ（10mg/L）：移取丙烯酰胺中間溶液1mL，用0.1%甲酸溶液稀釋至

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2

10mL，使丙烯酰胺濃度為10mg/L。臨用時(shí)配制。

3.3.1.4丙烯酰胺工作溶液Ⅱ（1mg/L）：移取丙烯酰胺工作溶液Ⅰ1mL，用0.1%甲酸溶液稀釋至

10mL,，使丙烯酰胺濃度為1mg/L。臨用時(shí)配制。

3.3.2

13C

3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液

3.3.2.113C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液（1000mg/L）：準(zhǔn)確稱取

13C

3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并

定容，使

13C

3-丙烯酰胺濃度為1000mg/L，置﹣20℃冰箱保存。

3.3.2.2內(nèi)標(biāo)工作溶液（10mg/L）：移取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液1mL，用甲醇稀釋至100mL，使

13C

3-丙烯酰

胺濃度為10mg/L，置﹣20℃冰箱保存。

3.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液

取6個(gè)10mL容量瓶，分別移取0.1mL、0.5mL、1mL丙烯酰胺工作溶液II（1mg/L）和0.5mL、

1mL和3mL丙烯酰胺工作溶液I（10mg/L）與內(nèi)標(biāo)工作溶液（10mg/L）0.1mL，用0.1%甲酸溶液稀

釋至刻度。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中丙烯酰胺的濃度分別為10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000

μg/L、3000μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度為100μg/L。臨用時(shí)配制。

4儀器和設(shè)備

4.1液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）。

4.2HLB固相萃取柱：6mL、200mg，或相當(dāng)產(chǎn)品。

4.3BondElut-Accucat固相萃取柱：3mL、200mg，或相當(dāng)產(chǎn)品。

4.4組織粉碎機(jī)。

4.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

4.6氮?dú)鉂饪s器。

4.7振蕩器。

4.8玻璃層析柱：柱長(zhǎng)30cm，柱內(nèi)徑1.8cm。

4.9渦旋混合器。

4.10超純水裝置。

4.11分析天平：感量為0.1mg。

4.12離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≤10000r/m。

5分析步驟

5.1試樣制備

5.1.1樣品提取

取50g試樣，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，﹣20℃冷凍保存。準(zhǔn)確稱取試樣1g～2g（精確到0.001g），加入10

mg/L13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)工作溶液10μL（或20μL），相當(dāng)于100ng（或200ng）的

13C

3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)，

再加入超純水10mL，振搖30min后，于4000r/m離心10min，取上清液待凈化。

5.1.2樣品凈化

注：任選下列一種方法進(jìn)行凈化。

5.1.2.1基質(zhì)固相分散萃取方法（選擇1）：在試樣提取的上清液中加入硫酸銨15g，振蕩10min，使

其充分溶解，于4000r/m離心10min，取上清液10mL，備用。如上清液不足10mL，則用飽和硫酸銨

補(bǔ)足。取潔凈玻璃層析柱，在底部填少許玻璃棉并壓緊，依次填裝10g無(wú)水硫酸鈉、2g硅藻土。稱取

5g硅藻土ExtrelutTM20與上述試樣上清液攪拌均勻后，裝入層析柱中。用70mL正己烷淋洗，控制流

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速為2mL/min，棄去正己烷淋洗液。用70mL乙酸乙酯洗脫丙烯酰胺，控制流速為2mL/min，收集乙

酸乙酯洗脫溶液，并在45℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)瓶殘?jiān)危看?mL），

并將其轉(zhuǎn)移至已加入1mL0.1%甲酸溶液的試管中，渦旋振蕩。在氮?dú)饬飨麓等ド蠈佑袡C(jī)相后，加入1mL

正己烷，渦旋振蕩，于3500r/m離心5min，取下層水相經(jīng)0.22μm水相濾膜過(guò)濾，待LC-MS/MS測(cè)定。

5.1.2.2固相萃取柱凈化（選擇2）：在試樣提取的上清液中加入5mL正己烷，振蕩萃取10min，于

10000r/m離心5min，除去有機(jī)相，再用5mL正己烷重復(fù)萃取一次，迅速取水相6mL經(jīng)0.45μm水相

濾膜過(guò)濾，待進(jìn)行HLB固相萃取柱凈化處理。HLB固相萃取柱使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化。

取上述濾液5mL上HLB固相萃取柱，收集流出液，并用4mL80%的甲醇水溶液洗脫，收集全部洗脫

液，并與流出液合并待進(jìn)行BondElut-Accucat固相萃取柱凈化；BondElut-Accucat固相萃取柱依次用

3mL甲醇、3mL水活化后，將HLB固相萃取柱凈化的全部洗脫液上樣，在重力作用下流出，收集全部

流出液，在氮?dú)饬飨聦⒘鞒鲆簼饪s至近干，用0.1%甲酸溶液定容至1.0mL，待LC-MS/MS測(cè)定。

5.2儀器參考條件

5.2.1色譜條件

色譜柱為AtlantisC18柱（5μm、2.1mmI.D.×150mm）或等效柱。

預(yù)柱：C18保護(hù)柱（5μm、2.1mmI.D.×30mm）或等效柱。

流動(dòng)相：甲醇/0.1%甲酸（10：90，體積分?jǐn)?shù)）。

流速：0.2mL/min。

進(jìn)樣體積：25μL。

柱溫：26℃。

5.2.2質(zhì)譜參數(shù)

5.2.2.1三重四極串聯(lián)質(zhì)譜儀

檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）。

電離方式：陽(yáng)離子電噴霧電離源（ESI+）。

毛細(xì)管電壓：3500V。

錐孔電壓：40V。

射頻透鏡1電壓：30.8V。

離子源溫度：80℃。

脫溶劑氣溫度：300℃。

離子碰撞能量：6eV。

丙烯酰胺：母離子m/z72、子離子m/z55、子離子m/z44。

13C

3丙烯酰胺：母離子m/z75、子離子m/z58、子離子m/z45。

定量離子：丙烯酰胺為m/z55，13C3丙烯酰胺為m/z58。

5.2.2.2離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀

檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（SRM）。

電離方式：陽(yáng)離子電噴霧電離源（ESI+）。

噴霧電壓：5000V。

加熱毛細(xì)管溫度：300℃。

鞘氣：N2，40Arb。

輔助氣：N2，20Arb。

碰撞誘導(dǎo)解離（CID）：10V。

碰撞能量：40V。

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丙烯酰胺：母離子m/z72、子離子m/z55、子離子m/z44。

13C

3丙烯酰胺：母離子m/z75、子離子m/z58、子離子m/z45。

定量離子：丙烯酰胺為m/z55，13C3丙烯酰胺為m/z58。

5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜系統(tǒng)，測(cè)定相應(yīng)的丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)的峰面積，以

各標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的丙烯酰胺進(jìn)樣濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以丙烯酰胺（m/z55）和13C3丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)

(m/z58)的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.4試樣溶液的測(cè)定

將試樣溶液注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜系統(tǒng)中，測(cè)得丙烯酰胺（m/z55）和13C3丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)(m/z58)

的峰面積比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中丙烯酰胺進(jìn)樣濃度（μg/L），平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次。

5.5質(zhì)譜分析

分別將試樣和標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀中，記錄總離子流圖和質(zhì)譜圖（見(jiàn)附錄A

中圖A.1～圖A.2）及丙烯酰胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以保留時(shí)間及碎片離子的豐度定性，要求所檢測(cè)的丙

烯酰胺色譜峰信噪比(S/N)大于3，被測(cè)試樣中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的保留時(shí)

間一致，同時(shí)被測(cè)試樣中目標(biāo)化合物的相應(yīng)監(jiān)測(cè)離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的色譜峰豐度比一

致，允許的偏差見(jiàn)表1。

表1定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度

（基線峰的%）

允許的相對(duì)偏差

(RSD)

＞50%±20%

＞20%～50%±25%

＞10%～20%±30%

≤10%±50%

6分析結(jié)果的表述

試樣中丙烯酰胺含量按公式（1）內(nèi)標(biāo)法計(jì)算：

M

fA

X

………………（1）

式中：

X——試樣中丙烯酰胺的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

A——試樣中丙烯酰胺（m/z55）色譜峰與

13C

3丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)(m/z58)色譜峰的峰面積比值對(duì)應(yīng)的

丙烯酰胺質(zhì)量，單位為納克（ng）；

f——試樣中內(nèi)標(biāo)加入量的換算因子（內(nèi)標(biāo)為10μL時(shí)f=1或內(nèi)標(biāo)為20μL時(shí)f=2）；

M——加入內(nèi)標(biāo)時(shí)的取樣量，單位為克（g）。

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字（或

小數(shù)點(diǎn)后1位）。

7精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。

8其他

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方法定量限為10μg/kg。

第二法穩(wěn)定性同位素稀釋的氣相色譜-質(zhì)譜法

9原理

本標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)，在試樣中加入13C3標(biāo)記的丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液，以水為提取溶劑，

試樣提取液采用基質(zhì)固相分散萃取凈化、溴試劑衍生后，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)

(MRM)或氣相色譜-質(zhì)譜儀的選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。

10試劑和材料

注：除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為超純水。

10.1試劑

10.1.1正己烷(n-C6H14)：分析純，重蒸后使用。

10.1.2乙酸乙酯(CH3COOC2H5)：分析純，重蒸后使用。

10.1.3無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4)：400℃，烘烤4h。

10.1.4硫酸銨[(NH4)2SO4]。

10.1.5硫代硫酸鈉（Na2S2O3﹒5H2O）。

10.1.6溴(Br2)。

10.1.7氫溴酸(HBr)：含量>48.0%。

10.1.8溴化鉀(KBr)。

10.1.9超純水，電導(dǎo)率（25℃）≤0.01mS/m。

10.1.10溴試劑。

10.1.11硅藻土：ExtrelutTM20或相當(dāng)產(chǎn)品。

10.2試劑配制

10.2.1飽和溴水：量取100mL超純水，置于200mL的棕色試劑瓶中，加入8mL溴，4℃避光放置

8h，上層為飽和溴水溶液。

10.2.2溴試劑：稱取溴化鉀20.0g，加超純水50mL，使完全溶解，再加入1.0mL氫溴酸和16.0mL

飽和溴水，搖勻，用超純水稀釋至100mL，4℃避光保存。

10.2.3硫代硫酸鈉溶液（0.1mol/L）：稱取硫代硫酸鈉2.48g，加超純水50mL，使完全溶解，用超

純水稀釋至100mL，4℃避光保存。

10.2.4飽和硫酸銨溶液：稱取80g硫酸銨晶體，加入超純水100mL，超聲溶解，室溫放置。

10.3標(biāo)準(zhǔn)品

10.3.1丙烯酰胺(CH2=CHCONH2)標(biāo)準(zhǔn)品：純度>99%。

10.3.2

13C

３-丙烯酰胺（13CH2=13CH13CONH2）標(biāo)準(zhǔn)品：純度>98%。

10.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

10.4.1丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)溶液：同3.3.1和3.3.2。

10.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液：取5個(gè)10mL容量瓶，分別移取0.1mL、0.5mL、2mL丙烯酰胺工作溶

液Ⅱ（1mg/L）和0.5mL及1mL丙烯酰胺工作溶液Ⅰ（1mg/L）與0.5mL內(nèi)標(biāo)工作溶液（1mg/L），

用超純水稀釋至刻度。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中丙烯酰胺濃度分別為10μg/L、50μg/L、200μg/L、500μg/L、

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1000μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度為50μg/L。臨用時(shí)配制。

11儀器和設(shè)備

11.1氣相色譜-四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)。

11.2色譜柱：DB-5ms柱（30m×0.25mmi.d.×0.25μm）或等效柱。

11.3組織粉碎機(jī)。

11.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

11.5氮?dú)鉂饪s器。

11.6振蕩器。

11.7玻璃層析柱：柱長(zhǎng)30cm，柱內(nèi)徑1.8cm。

11.8渦旋混合器。

11.9超純水裝置。

11.10分析天平：感量為0.1mg。

11.11離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≤10000r/m。

12分析步驟

12.1試樣制備

12.1.1樣品提取

取50g試樣，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，﹣20℃冷凍保存。準(zhǔn)確稱取試樣2g(精確到0.001g），加入10.0mg/L

13C

3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液10μL（或20μL），相當(dāng)于100ng（或200ng）的

13C

3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)，再加入超

純水10mL，振蕩30min后，于4000r/m離心10min，取上清液備用。

12.1.2樣品凈化

在試樣提取的上清液中加入硫酸銨15g，振蕩10min，使其充分溶解，于4000r/m離心10min，

取上清液10mL，備用。如上清液不足10mL，則用飽和硫酸銨補(bǔ)足。取潔凈玻璃層析柱，在底部填少

許玻璃棉，壓緊，依次填裝無(wú)水硫酸鈉10g、ExtrelutTM20硅藻土2g。稱取5gExtrelutTM20硅藻土與

上述備用的試樣上清液攪拌均勻后，裝入層析柱中。用70mL正己烷淋洗，控制流速為2mL/min，棄

去正己烷淋洗液。用70mL乙酸乙酯洗脫，控制流速為2mL/min，收集乙酸乙酯洗脫溶液，并在45℃

水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)瓶殘?jiān)危看?mL），并將其轉(zhuǎn)移至已加入1mL

超純水的試管中，渦旋振蕩。在氮?dú)饬飨麓等ド蠈佑袡C(jī)相后，加入1mL正己烷，渦旋振蕩，于3500r/m

離心5min，取下層水相備用衍生。

12.1.3衍生

試樣的衍生：在試樣提取液中加入溴試劑1mL，渦旋振蕩，4℃放置至少1h后，加入0.1mol/L硫

代硫酸鈉溶液約100μL，渦旋振蕩除去剩余的衍生劑；加入2mL乙酸乙酯，渦旋振蕩1min，于4000

r/m離心5min，吸取上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至加有0.1g無(wú)水硫酸鈉的試管中，加入乙酸乙酯2mL重復(fù)萃取，

合并有機(jī)相；靜置至少0.5h，轉(zhuǎn)移至另一試管，在氮?dú)饬飨麓抵两?，?.5mL乙酸乙酯溶解殘?jiān)ㄗ?/p>

意：根據(jù)儀器的靈敏度，調(diào)整溶解殘?jiān)囊宜嵋阴ンw積，通常情況下，采用串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，其使用量

為0.5mL，采用單級(jí)質(zhì)譜儀檢測(cè)，其使用量為0.1mL。），備用。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的衍生：量取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各1.0mL，按照上述試樣衍生方法同步操作。

13儀器參考條件

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13.1色譜條件

色譜柱：DB-5ms柱（30m×0.25mmI.D.×0.25μm）或等效柱。

進(jìn)樣口溫度：120℃保持2min，以40℃/min速度升至240℃，并保持5min。

色譜柱程序溫度：65℃保持1min，以15℃/min速度升至200℃，再以40℃/min的速度升至240℃，

并保持5min。

載氣：高純氦氣（純度>99.999%），柱前壓為69mPa，相當(dāng)于10psi。

不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1μL。

13.2質(zhì)譜參數(shù)

檢測(cè)方式：選擇離子掃描（SIM）采集。

電離模式：電子轟擊源（EI），能量為70eV。

傳輸線溫度：250℃。

離子源溫度：200℃。

溶劑延遲：6min；質(zhì)譜采集時(shí)間：6min~12min。

丙烯酰胺監(jiān)測(cè)離子為m/z106、133、150和152，定量離子為m/z150。

13C

3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)離子為m/z108、136、153和155，定量離子為m/z155。

13.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將衍生的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，測(cè)定相應(yīng)的丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)的峰面積，

以各標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的丙烯酰胺進(jìn)樣濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)13C3丙烯酰胺定量離

子質(zhì)量色譜圖上測(cè)得的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制線性曲線。

13.4試樣溶液的測(cè)定

將衍生的試樣溶液注入氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)中，得到丙烯酰胺