1、碩士研究生實(shí)驗(yàn)，一，t細(xì)胞球表型測(cè)定(一)二，小鼠脾細(xì)胞球分離技術(shù)，濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室迪大林Tel:2608468 Email :實(shí)驗(yàn)一，t細(xì)胞球表型測(cè)定(一)-免疫細(xì)胞球分離，細(xì)胞球包衣t細(xì)胞球通過(guò)細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)b細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答發(fā)揮輔助和調(diào)節(jié)作用。 t細(xì)胞球共有標(biāo)識(shí)牌： CD3為總細(xì)胞球t細(xì)胞球特有標(biāo)識(shí)牌： CD4細(xì)胞球?yàn)檩o助細(xì)胞球，CD8細(xì)胞球?yàn)闅?xì)胞。 t淋巴細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)牌，正常值：正常人外周血中： CD3占60% 80%； CD4占35% 55%； CD8為20% 30% CD4/CD8的正常值約1.42.0。 CD4CD81.4:HIV等免疫缺乏癥之比通常小于0.5的

2、罹患癌癥再生障礙性貧血的一部分細(xì)小病毒感染。 CD4CD82.0:sle、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。 t淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè)有助于了解機(jī)體細(xì)胞免疫功能，對(duì)免疫缺乏、腫瘤、自身免疫性疾病、細(xì)小病毒感染、移植移植排斥反應(yīng)等疾病的診斷、分型、預(yù)后與療效觀察具有重要意義。 SABC-AP法測(cè)定t細(xì)胞球亞群，SABC :鏈霉親和素，AP為堿性磷酸酯酶。 鏈霉親和素：從雞蛋清中提取的糖蛋白。 分子量60kD由每個(gè)分子4個(gè)亞單位組成，可以與4個(gè)生物素分子結(jié)合。 親和素和生物素結(jié)合后極其穩(wěn)定，形成格子狀復(fù)合體。 實(shí)驗(yàn)基本流程、實(shí)驗(yàn)材料、肝素、淋巴細(xì)胞分層液、Hanks液、PBS等一次性物品注射器、試管

3、、吸管、離心機(jī)、微量移液器、玻璃板、顯微鏡、溫箱等。 小鼠抗人CD3、CD4、CD8單克隆抗體(1抗)羊抗小鼠IgG (生物素化2抗) SABC-AP； 基質(zhì)(BCIP/NBT磷酸甲苯胺藍(lán)鹽)等。 實(shí)驗(yàn)步驟、標(biāo)本制備：淋巴細(xì)胞混懸劑制備標(biāo)本染色：結(jié)果觀察：標(biāo)本制備：淋巴細(xì)胞混懸劑制備，(1)稀釋攪拌5ml肝素抗凝血和5ml Hanks液，各組取2ml，用吸管將管壁輕重疊于2ml分離液，配制(2) 清洗細(xì)胞球：用吸管經(jīng)常吸出血漿與分離液之間的乳白色淋巴細(xì)胞，放入裝有2 ml Hanks液的試管中，以1500rpm離心10分鐘，丟棄上清，將沉淀的淋巴細(xì)胞輕彈混合后加入hanks液反復(fù)清洗，最后用P

4、BS清洗。 (3)扔掉上清，用200lPBS溶解淋巴細(xì)胞沉淀，取20l細(xì)胞球涂層，在下面的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出t細(xì)胞球亞群用。 標(biāo)本染色，細(xì)胞球涂膜用符號(hào)筆畫(huà)，滴下固定液1滴，室溫固定23分鐘。 滴加小鼠抗人CD3、CD4、CD8抗體15L，輕輕搖晃，單抗均勻地鋪在細(xì)胞表面上，37孵化23h、PBS清洗3次。 滴加生物素標(biāo)識(shí)牌羊抗小鼠抗體15L，37培養(yǎng)3045分鐘，用PBS洗滌3次。 滴入SABC 15L，37孵化3045分鐘，PBS清洗3次。 滴加顯色劑3050L，在室溫下顯色2040分鐘。 用顯微鏡可以觀察，當(dāng)胞質(zhì)膜上出現(xiàn)紅色標(biāo)記時(shí)，用PBS沖洗。 滴入1滴細(xì)胞核的復(fù)染液，30秒后用自來(lái)水沖洗。

5、 在顯微鏡下觀察結(jié)果。 注意事項(xiàng)：以上操作中，37孵化時(shí)請(qǐng)將玻璃板放入濕箱中，不要干燥。 特別是加入基質(zhì)的話，干燥片就不能分辨陰陽(yáng)性的結(jié)果了。 觀察結(jié)果時(shí)，涂膜應(yīng)保持濕潤(rùn)狀態(tài)。 觀察結(jié)果，高倍鏡下修訂了100200個(gè)單核細(xì)胞。 修正陽(yáng)性模量。 陽(yáng)性細(xì)胞球：細(xì)胞表面呈紅色。 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性：細(xì)胞表面呈紅色，可見(jiàn)深藍(lán)色細(xì)胞核的強(qiáng)陽(yáng)性：細(xì)胞球邊緣及中央均呈紅色，看不到細(xì)胞核的弱陽(yáng)性：細(xì)胞表面呈淡紅色，可見(jiàn)淺藍(lán)色細(xì)胞核的陰性細(xì)胞球：細(xì)胞表面無(wú)著色反應(yīng)，呈淡藍(lán)色。 注意事項(xiàng)：為避免試劑被污染，最好同時(shí)使用進(jìn)樣器芯片。 分離單核細(xì)胞球，將稀釋血液加入分層液時(shí)，必須形成良好的界面，以免影響分離結(jié)果。孵化過(guò)程中，應(yīng)

6、將涂膜放入濕箱中，作業(yè)過(guò)程中始終保持涂膜濕潤(rùn)，注意得到完美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 淋浴清洗時(shí)不要直接向細(xì)胞球沖去，以免細(xì)胞球脫落。 淋浴后，在加入試劑之前要擦去細(xì)胞球外面的水分，使試劑不流動(dòng)。 實(shí)驗(yàn)二小鼠脾細(xì)胞球分離與制備技術(shù)，小鼠脾細(xì)胞球分離，細(xì)胞球修訂數(shù)板細(xì)胞球修訂數(shù)，胎盤(pán)藍(lán)染色細(xì)胞活力檢查。 實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：老鼠。 培養(yǎng)液。 試管、吸管、離心分離機(jī)、培養(yǎng)皿、100目細(xì)胞球篩等。 選擇老鼠，拔下頸椎處死，用碘酒、酒精消毒毛皮。 切開(kāi)皮膚打開(kāi)腹腔。 發(fā)現(xiàn)紅色脾臟，用大頭針定徑套分離取出。 將脾臟放入裝有培養(yǎng)液5-10ml的平皿中輕輕沖洗，仔細(xì)剝下脾臟周?chē)慕Y(jié)締組織。 將脾臟轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有培養(yǎng)液的

7、平皿中，輕輕沖洗后裝入100目的細(xì)胞球篩中，輕輕按壓將脾細(xì)胞球通過(guò)篩子孔裝入培養(yǎng)液中，反復(fù)洗滌得到脾細(xì)胞球混懸劑。 1、分離小鼠脾細(xì)胞球，收集分離的脾細(xì)胞球，在10ml離心管內(nèi)注入培養(yǎng)液吹走，取出10l細(xì)胞球，與10l胎盤(pán)藍(lán)染色液混合染色，觀察細(xì)胞球活力，對(duì)云同步進(jìn)行細(xì)胞球訂正數(shù)。 細(xì)胞球活力觀察(臺(tái)望藍(lán)染色):當(dāng)細(xì)胞球損傷或死亡時(shí)，臺(tái)望藍(lán)透過(guò)變性的胞質(zhì)膜，與解體的DNA結(jié)合，被染成淺藍(lán)色，活細(xì)胞球阻止染料進(jìn)入細(xì)胞球內(nèi)，可鑒別死細(xì)胞球和活細(xì)胞球。 細(xì)胞球訂數(shù)：使用細(xì)胞球訂數(shù)板。 2、細(xì)胞球活力觀察和校正數(shù)、材料：4%臺(tái)望青母液(4g臺(tái)望青，加入蒸餾水研磨，雙蒸餾水加入100ml，用濾紙過(guò)濾，保存4個(gè)。 使用時(shí)，用PBS稀釋為0.4% )、血細(xì)胞修正數(shù)板、顯微鏡等。 工序：制備單細(xì)胞球混懸劑染色：取10l細(xì)胞球混懸劑和10l臺(tái)望藍(lán)溶液混合，訂正數(shù)： 3分鐘以?xún)?nèi)，生細(xì)胞球和死細(xì)胞分別用訂正數(shù)板訂正。 注意事項(xiàng)：臺(tái)望藍(lán)對(duì)人體有毒，盡量不要直接接觸。 染色時(shí)間不能太長(zhǎng)。 否則，一些活著的細(xì)胞球也會(huì)著色，妨礙訂正數(shù)。臺(tái)望藍(lán)染色、細(xì)胞球修訂數(shù)：步驟：用乙醇清洗修訂數(shù)板及專(zhuān)用玻璃罩，然后用絲布輕輕擦拭微量移液器采集少量細(xì)胞球混懸劑(10l )，將細(xì)胞球樣品從腔室一口注入，液體向腔室擴(kuò)散，空氣從另一口排出注意事項(xiàng)：對(duì)