1、質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳,小組成員：楊松，祁平新，譚華發(fā)，禮 莊曾,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的原理和方法。,實(shí)驗(yàn)原理,DNA分子在瓊脂糖中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。 在 pH 值為 8.08.3 時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。 采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。 核酸分子中嵌入熒光染料（如 EB ）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。,實(shí)驗(yàn)器材和試劑,實(shí)驗(yàn)器材： 制膠模具，水平式電泳槽，電泳

2、儀，微量移液器, 微波爐, 紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。 樣品： DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)粒 試劑 瓊脂糖 1電泳緩沖液（TBE） 6上樣緩沖液 溴化乙錠(EB) ：10mg/ml,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。 該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。 當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。 此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。,瓊脂糖凝膠,天然瓊脂（ag

3、ar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉 從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。,瓊脂糖（agarose） 瓊脂膠（agaropectin）:含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象。,瓊脂,瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn),(1) 操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進(jìn)行電泳。 (2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。 (3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外監(jiān)測及定量分析。 (4)電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。,缺點(diǎn)： 1.機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。 2.易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前

4、配制。 3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。 4.與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。,影響瓊脂糖凝膠電泳的因素,DNA分子的大?。簩?shí)驗(yàn)證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對數(shù)成反比； 瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同； DNA分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。,上樣緩沖液,0.25溴酚蘭；0.25二甲苯青；30甘油水溶液 作用： 增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi) 在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置 使樣品呈色，使加樣操作更方便,電泳指示劑： 核酸電泳常用

5、的指示劑有兩種 溴酚藍(lán)（ bromophenol blue, Bb ）； 二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍(lán)慢。,核酸電泳的染色劑,最常用的染色劑 溴化乙錠 銀染色,溴化乙錠（ethidium bromide，EB） 是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光 可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min EB染料有許多優(yōu)點(diǎn)，如染色操作簡便、快速，靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出。,注意：EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物

6、質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)盡量小心，配置和使用EB時(shí)都應(yīng)帶上手套，且注意不要把EB灑到桌面或地板上。,銀染色 銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染成黑褐色。 主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。 靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收,實(shí)驗(yàn)操作,操作步驟,1. 準(zhǔn)備 用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子,2. 配制1%瓊脂糖凝膠及倒膠,具體步驟： 三角瓶內(nèi)：1g瓊脂糖 +100ml(1TBE) 煮膠溶解 冷卻至60(不燙手) 加EB 倒板 室溫下充分凝固 垂直向上拔出梳子 將膠板放入

7、電泳槽 向電泳槽中加入1xTBE緩沖液至剛沒過凝膠表面。,3. 加樣,將DNA樣品（5ul）與6 上樣緩沖液（1ul） 混勻后，用微量加樣槍小心加入樣品孔內(nèi)。 注意加樣槍的槍頭不可插入過深，以免刺穿凝膠，導(dǎo)致樣品外溢。 每加完一個(gè)樣品要更換槍頭，以防止EB污染。,4. 電泳,接通電源，一般紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)），電壓為5 V/cm（長度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算） 根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳,5. 結(jié)果觀察,電泳結(jié)束后，將凝膠板取出。在紫外儀上觀察電泳帶及其位置，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,注意事項(xiàng),1、 倒膠時(shí)把握好膠的溫度，不要高于60 ，否則溫度太高會(huì)使制板變形； 2、 膠一定