1、飼用益生菌及其應(yīng)用,1,2010年下半年尤其是8、9月份，河南及其周邊的安徽、江蘇、河北、山東一帶，相繼發(fā)生了豬類似前兩年的高熱病。對此有專家進(jìn)行了流行病學(xué)的調(diào)研， 發(fā)現(xiàn)本次豬病的流行表現(xiàn)主要是發(fā)熱及細(xì)菌和病毒混合多重感染，給臨床診斷帶來了很大困難。很多疾病，僅免疫抑制性疾病的存在就影響了疫苗免疫效果。耐藥菌株的出現(xiàn)使抗生素的療效越來越差，甚至出現(xiàn)一用藥便加速豬只死亡的現(xiàn)象。,2,隨著我國集約化養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，病害的大規(guī)模暴發(fā)，大量抗生素及其他違禁藥物被用于疾病防治，引起了細(xì)菌抗藥性及藥物殘留等一系列問題，嚴(yán)重影響了我國畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。為了解決養(yǎng)殖病害和食品安全等諸多矛盾，尋找綠色環(huán)保

2、的抗生素替代品是目前的研究熱點。 由此，益生菌產(chǎn)品應(yīng)運而生。,3,一.益生菌的定義,益生菌(Probiotics) , 又稱微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、生態(tài)制品、活菌制劑，是指能夠促進(jìn)腸內(nèi)生態(tài)菌群生態(tài)平衡對宿主起有益作用的活的微生物制劑。 Fuller (1989 年) 將其定義為“一種通過改善腸道菌群平衡而對動物施加有利影響的活的微生物飼料添加劑。”這也是目前被普遍接受的有關(guān)益生菌的定義。,4,二.益生菌種類,第一代：乳酸菌類益生菌 第二代：雙歧桿菌 第三代：LGG（鼠李糖乳桿菌）,美國人發(fā)現(xiàn)的新型微生物，由健康人體腸道分離得到。目前， 美國Hansen、芬蘭Valio、日本Yakult、荷蘭DSM等公司

3、均在生產(chǎn)第三代益生菌產(chǎn)品。,芽孢桿菌,5,被我國批準(zhǔn)使用的益生菌有：芽孢桿菌、乳酸桿菌、糞鏈球菌、酵母菌、黑曲菌、米曲菌。 目前作為獸藥和飼料添加劑的益生菌菌種主要有 芽孢桿菌屬 乳酸桿菌屬 酵母,6,單菌制劑,復(fù)合制劑,現(xiàn)在已知含菌種數(shù)目最多的益生菌是日本的EM(有效微生物群) ,它由5 科10 屬幾十種微生物復(fù)合而成,在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和環(huán)保等領(lǐng)域都取得了明顯的效果。 我國最近研制出由30 多種微生物組成的SEM 科隆粉I ,在養(yǎng)雞、養(yǎng)魚的試驗中取得了較好的效果。,7,8,在工業(yè)生產(chǎn)條件下,菌種應(yīng)保持存活; 應(yīng)能在長期儲存和現(xiàn)場條件下保持穩(wěn)定和活性; 在動物腸道有存活能力(不一定繁殖) ;

4、能對宿主動物產(chǎn)生有利的影響。,1.特點,三.飼用益生菌的應(yīng)用,9,2.宿主,豬 雞 牛 魚 蝦 （狗）,仔豬，育肥豬,雛雞，蛋雞，肉雞,犢牛，奶牛，育肥牛,10,3.效果,豬 雞 牛 魚 蝦 （狗）,在育肥豬日糧中添加益生菌，與添加抗生素的效果一樣，能提高飼料轉(zhuǎn)化率。 在仔豬日糧中添加益生菌，可增加斷奶體重，降低斷奶仔豬黃白痢發(fā)病率。,早期飼喂乳酸桿菌的雛火雞，其死亡率明顯低。 在蛋雞日糧中飼喂益生菌，其產(chǎn)蛋率、飼料轉(zhuǎn)化率、生長速度和飼料利用率都提高。,水產(chǎn)中使用可改善魚蝦肉質(zhì)，凈化水質(zhì),在犢牛的代乳飼料中添加益生菌，可提高犢牛的日增重和飼料報酬，發(fā)病率降低。 奶牛飼喂益生菌，可使產(chǎn)奶量提高，

5、乳蛋白含量提高。,11,12,4.作用機理,保持腸道內(nèi)微生態(tài)平衡 畜禽胃腸道菌群是在長期進(jìn)化過程中形成并與畜禽保持相對平衡穩(wěn)定狀態(tài)的菌群，它對畜禽的生長發(fā)育和抵抗疾病的能力具有重要意義。當(dāng)畜禽胃腸道微生物平衡失調(diào)時，畜禽出現(xiàn)生產(chǎn)性能下降和疾病癥狀。 產(chǎn)生各種酶 益生菌可產(chǎn)生水解酶、發(fā)酵酶和呼吸酶，這些酶有利于降解飼料中蛋白質(zhì)、脂肪和較復(fù)雜的碳水化合物。,13,抗感染 益生菌能增強畜禽免疫功能，合成細(xì)菌素、有機酸、溶菌酶、過氧化氫等物質(zhì)，對有害菌有拮抗作用。 生物奪氧 一些需氧菌特別是芽孢桿菌會消耗腸道內(nèi)氧氣，造成厭氧環(huán)境，有助于厭氧微生物的生長，從而使失調(diào)的菌群平衡調(diào)整恢復(fù)到正常狀態(tài)。 此外，

6、益生菌還有合成維生素B族、抑制有害物質(zhì)生成，產(chǎn)生抗菌素類物質(zhì)及屏障作用等作用機制的說法。,14,5.豬腸道益生菌種類,十二指腸內(nèi)優(yōu)勢菌群依次為雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌,直腸內(nèi)優(yōu)勢菌群依次為雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、腸桿菌,盲腸內(nèi)優(yōu)勢菌群依次為雙歧桿菌、腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌,回腸內(nèi)優(yōu)勢菌群依次為雙歧桿菌、腸球菌、腸桿菌、乳酸桿菌,15,6.飼用益生菌研究手段,傳統(tǒng)方法 包含形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)等，這些方法都基于微生物表面受體的特異性，屬于表型分類法。,16,分子生物學(xué)方法 DNADNA 分子雜交技術(shù) recA 基因序列分析 GC含量 基于16S 或23S rRNA

7、序列的DNA 標(biāo)記技術(shù) 變性梯度凝膠電泳,17,1. DNADNA 分子雜交技術(shù),將菌落裂解，使細(xì)胞內(nèi)DNA 暴露，即可直接采用探針與該菌落進(jìn)行原位雜交。對探針采用同位素、酶或熒光素標(biāo)記后，可以使其容易被檢測。目前，該方法已經(jīng)被用來制備對雙歧桿菌具有菌株或種特異性的核酸探針。,18,2. recA 基因序列分析,recA 基因負(fù)責(zé)編碼recA蛋白質(zhì)， 后者在DNA 重組、DNA 修復(fù)與SOS 應(yīng)急反應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用。研究表明，recA 基因的一個小片段有望成為一種靈敏性高、能用于種間進(jìn)化發(fā)育親緣研究的分子標(biāo)記。,19,3. GC含量,同種生物體內(nèi)的GC是固定的，但不同種生物的GC會有很大

8、的不同。測定GC的方法很多， 其中最廣泛和通用的方法是以化學(xué)法水解DNA 后， 再用電泳或HPLC 來分析其中成分。DNA 的GC含量測定已廣泛用于微生物鑒定中。,20,4. 基于16S或23S rRNA序列的DNA 標(biāo)記技術(shù),16S 或23S rRNA序列的DNA 標(biāo)記技術(shù)利用PCR 的方法， 采用針對16S rRNA 基因兩端通用保守區(qū)的引物直接對所分離到的菌株進(jìn)行16S rRNA 基因擴增， 然后測定整個PCR 復(fù)制子（約15 kb）的序列組成，并與rRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。,21,DGGE是利用一個梯度變性膠來分離DNA 片段。由于不同DNA 片段的變性條件不同，因此可在凝膠上形成不同

9、的泳帶。它是一種快速、可靠、重復(fù)性好的益生菌（能夠產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物）非培養(yǎng)檢測和分析方法，它比傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測鑒定方法應(yīng)用前景廣闊。,5. 變性梯度凝膠電泳,22,其他研究方法,編碼和自動化鑒定系統(tǒng) 編碼鑒定方法是指根據(jù)鑒定對象采用一定數(shù)目卡，所得結(jié)果以數(shù)字方式表達(dá)，并與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對照而得出鑒定結(jié)果。近年發(fā)展起來的益生菌自動化鑒定系統(tǒng)實現(xiàn)了從接種、培養(yǎng)、讀數(shù)到報告的全過程自動化。 熒光光譜法 它利用物質(zhì)所發(fā)射的熒光強度與濃度之間的線性關(guān)系進(jìn)行定量分析，并以熒光光譜的形狀和熒光峰對應(yīng)的波長進(jìn)行定性分析。,23,以豬用益生菌為例,由于尚無適合所有腸道細(xì)菌生長的選擇性培養(yǎng)基，而傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)難于反映腸道

10、微生物區(qū)系的全貌，因此常采用PCR-DGGE法。 變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)，因能有效分析復(fù)雜微生物群落及其多樣性，而廣泛用于研究哺乳動物腸道微生物區(qū)系。,24,實驗方法：,采集健康豬的糞便 提取總DNA，PCR擴增 進(jìn)行DGGE和DGGE凝膠的分析 16S rDNA全序列的克隆和序列分析 GenBank搜索同源序列,25,7.益生菌與環(huán)境,26,8.安全性,評價益生菌的安全性現(xiàn)狀主要包括以下幾個方面： 益生菌潛在的感染性 有毒代謝活動 過度的免疫作用 耐藥基因轉(zhuǎn)移,27,有些乳酸菌有可能是潛在的致病菌，一旦成為致病原，由于它們具有耐藥性將無法利用抗生素對其進(jìn)行治療。而且更重要的是，有些乳酸菌的耐藥性具有可轉(zhuǎn)移性，可能會轉(zhuǎn)移到其它乳酸菌或致病菌中，對人類產(chǎn)生威脅。,大部分乳酸菌對抗革蘭氏陰性菌的抗生素具有耐藥性，例如鏈霉素，慶大霉素和卡那霉素。,28,9.發(fā)展趨勢,與抗生素的配伍 與