1、第六章 食品中微生物數(shù)量的檢測技術與指示菌類,1,一、食品中的菌數(shù)檢測技術及其新進展 二、指示菌類 三、其他菌類數(shù)量的檢測方法,2,第一節(jié) 食品中的菌數(shù)檢測方法及其新進展,一、顯微鏡直接計數(shù)法 二、平皿菌落總數(shù)測定法 三、最近似數(shù)測定法 四、還原試驗法 五、其它方法,3,中華人民共和國食品衛(wèi)生法第四條指出：“食品應當無毒、無害，符合應當有的營養(yǎng)要求，具有相應的色、香、味等感官性狀”。 這一條就明確地規(guī)定了食品的衛(wèi)生要求。,食品的衛(wèi)生要求,4,檢測食品中微生物數(shù)量的衛(wèi)生學意義：,可作為食品被微生物污染程度的標志（或食品清潔狀態(tài)的標志）。 預測食品貯存期限（保質(zhì)期）。 食品中細菌總數(shù)還能反映食品的

2、新鮮程度、是否發(fā)生變質(zhì)。,5,理想情況： 理想的檢測方法是對所有食品都適用，并在短時間內(nèi)獲得準確結果。 實際上： 至今還沒有一種通用的方法能準確測出食品中的實際活菌數(shù)，都有一定的誤差、適用范圍和優(yōu)缺點。,6,一、顯微鏡直接計數(shù)法（DMC）,1、直接涂片計數(shù)法 （1）操作方法 將0.01mL經(jīng)適當稀釋的樣品均勻涂布于載玻片上的1cm2面積的方格內(nèi)，經(jīng)干燥、固定、革蘭氏染色后，用顯微鏡觀察計數(shù)。 在計數(shù)前先用物鏡測微尺測出油鏡視野的直徑，再觀察計算1015個視野的細菌總數(shù)，求出平均數(shù)。,r顯微鏡油鏡視野的半徑（mm） B稀釋倍數(shù),7,涂片：接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻 熱固定：通過火焰若干

3、次 初染：結晶紫一滴，1min，水洗 媒染：碘液一滴，1min，水洗 脫色：95%乙醇，約30s 復染：復紅一滴，30s,8,9,10,11,12,13,14,（2）特點 操作簡便、快捷 不能區(qū)分活菌與死菌，計數(shù)結果偏高，只適用于菌數(shù)較高的樣品 只適用于計數(shù)單細胞的微生物,15,2、血球計數(shù)板計數(shù)法,將適當稀釋的樣品注入血球板的計數(shù)室中。由于計數(shù)室的容積是已知的（0.1mm3），計算一定微小體積內(nèi)的菌數(shù)，即可計算出每克或每毫升樣品中的菌數(shù)。,16,菌體細胞數(shù)（cfu/ml）=小格內(nèi)平均菌體細胞數(shù)400104稀釋倍數(shù),17,特點 操作簡便、快速，可在十分鐘內(nèi)得到結果。待測標本未經(jīng)火焰固定殺死細胞

4、，故所測結果為活菌數(shù)。 此法適用于計數(shù)單細胞的酵母菌。,18,二、平皿菌落總數(shù)測定法（SPC）,平皿菌落總數(shù)測定法是最常用的一種活菌計數(shù)法，也是我國衛(wèi)生標準規(guī)定的公認可行的方法，因此又稱標準平皿活菌計數(shù)法。,19,菌落總數(shù)： 食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培基基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。 只包括一群在平板技術瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)不等于細菌總數(shù)。 CFU：菌落形成單位,20,國標（GB）規(guī)定：,在需氧條件下： 細菌： PCA 361 48h 霉菌、酵母： PDA或孟加拉紅培養(yǎng)基 281 5d,21,酵母菌

5、、霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上典型特征,22,菌落總數(shù)的測定 平板菌落計數(shù)法程序,23,（一）樣品采集,1、采樣原則： 確定性、隨機性、代表性、無菌操作、原始性 2、采樣方法： 無菌操作，分類操作 有包裝食品 應采用完整的未開封的樣品 粉末狀樣品 邊混合邊取樣 液體樣品 振搖均勻取樣 冷凍樣品 保持冷凍狀態(tài) 非冷凍樣品 保存在05,24,3、采樣數(shù)量和部位： （1）即食類預包裝食品： 取相同批次最小零售原包裝 （2）非即食類預包裝食品： 500mL液態(tài)食品 混勻后，從相同批次的不同 容器中取5倍檢驗單位樣品 500g固體食品 從同一包裝的不同部位分別取樣 （3）散裝或現(xiàn)場制作食品 根據(jù)食品不同類別和

6、性質(zhì)，取5倍檢驗單位樣品,25,4、采樣標記： 及時、準確、清晰填寫采樣單（包括采樣人、采樣地點、時間、樣品名稱、來源、批號、數(shù)量、保存條件等信息）。 5、采樣的貯存和運輸： 應在接近原溫條件下盡快送檢，并保持樣品完整。如不能及時運送，應在接近原溫條件下貯存。,26,代表單位（章） 代表單位（章） 簽字 簽字 日期年月日 日期 年月日,采樣單,27,（二）送檢,認真核對登記樣品信息 應按要求盡快檢驗。如不能及時檢驗，應采取必要措施保持樣品原有狀態(tài) 冷凍食品45以下不超過15分鐘，或2 5不超過18h解凍后檢驗 不得加入防腐劑保存,28,（三）樣品的處理和稀釋,1）取樣 無菌操作25g（mL）放

7、入225mL無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中（1:10稀釋液） 2）均勻混合 無菌均質(zhì)杯800010000 r/min均質(zhì)12 min，或用拍擊式均質(zhì)器拍打12 min,29,30,3）稀釋,31,4）傾注平板,稀釋液移入平皿后，將46 左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，轉(zhuǎn)動平皿。,32,33,34,5）倒置培養(yǎng),瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板 細菌：一般食品 361 48h 水產(chǎn)品 301 72h 霉菌： 281 5d,35,（四）菌落計數(shù)法,肉眼觀察（直接、放大鏡） 利用自動影像分析菌落計數(shù)儀,36,結果表述,37,（五）菌落計數(shù)的報告,報告單位：cfu/g(mL) 1、平板菌落數(shù)的選擇： 3

8、0300cfu 2、菌落數(shù)的計算： 3、菌落數(shù)的報告： 低于30時 按實數(shù)報告 100cfu以內(nèi)時 按四舍五入修約，采用兩位有效 數(shù)字報告 100時 第三位數(shù)四舍五入修約，取前兩 位數(shù)字 例：205043210000 or 2.1105,38,先倒平板，待其凝固后，吸取0.1ml稀釋液于平板表面上，用無菌玻璃刮鏟在整個平板上均勻涂布，培養(yǎng)觀察。,涂布平板法,39,40,涂布法的優(yōu)缺點,可檢測到熱敏性菌株 菌落形態(tài)比較明顯 更適合于嚴格的好氧菌 沒有傾注法簡便，易造成機械損傷,41,三、最近似數(shù)測定法（most probable number MPN）,對未知樣品做連續(xù)的10倍稀釋，選擇3個連續(xù)

9、的10倍稀釋液，每種稀釋液接種3管（5管）裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)實驗結果查MPN檢索表，得到樣品中微生物的數(shù)量。,42,43,根據(jù)經(jīng)確證后的對應濃度陽性管數(shù)查MPN表 MPN：最可能數(shù)，基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法,44,45,MPN的優(yōu)點：,操作簡便 與SPC相比，相似率較高 采用選擇性培養(yǎng)基可檢測特殊微生物菌群 特別適用于檢測食品內(nèi)含菌量較少的樣品,46,MPN的缺點：,需要大量的玻璃器皿 不能觀察微生物菌落形態(tài) 要注意嚴格的無菌操作,47,食品冷飲大腸菌群檢驗紙片冷飲、乳制品和調(diào)味品等大腸菌群的測定,48,餐具大腸菌快速檢驗紙片餐具衛(wèi)生消毒效果檢測,49,四、還原試驗法,一種估計

10、活性微生物數(shù)量的方法 原理： 微生物細胞在進行生物代謝的氧化還原過程中，有的被氧化，有的被還原，測定還原能力即可推測樣品內(nèi)的菌數(shù)。 某些指示劑和色素可反映這個變化，這些成分的還原時間同細菌數(shù)量成反比。,50,三種染料： 美藍： 美藍（藍色） 無色 刃天青： 刃天青（藍色） 粉紅色或無色 紅四氮唑（TTC）： 紅四氮唑（無色） 粉色或紅色,51,美藍還原試驗表,美藍：美藍（藍色） 無色,52,韌天青還原試驗表,刃天青： 刃天青（藍色） 粉紅色或無色,53,顯色狀態(tài)判斷標準,紅四氮唑（TTC）： 紅四氮唑（無色） 粉色或紅色,54,應用及優(yōu)、缺點：,應用： 乳品工業(yè)上原料乳中的微生物檢測 優(yōu)點：

11、簡便、快捷、經(jīng)濟 缺點： 所得結果不夠準確 不適用于含有還原性酶的食品,55,五、濁度測量法,原理 利用濁度計或分光光度計測定培養(yǎng)液中微生物的生長量。當某一波長的光線通過混濁的液體后，光的強度被減弱。因為菌體不透光，在一定濃度范圍內(nèi)，懸液中單細胞的數(shù)量與光密度（OD值）成正比。,56,當細菌濃度達到107個/ml時，培養(yǎng)基會渾濁,57,優(yōu)點： 樣品數(shù)量較多時，此法與SPC方法相比省時省力。 缺點： 若樣品顏色較深或含有固體顆粒時，不宜采用。,58,菌數(shù)測定方法,直接法,間接法,顯微鏡直接計數(shù)法,平板菌落總數(shù)測定法,還原試驗法,最近似數(shù)測定法,濁度測量法,ATP生物發(fā)光法,試驗測定法,電阻抗測量

12、法,放射測量法,但至今沒有一種常用的方法能準確測出食品中的實際活菌數(shù)，也沒有一種方法對所有的食品都適用。,59,第二節(jié) 指示菌類,一般情況下，若要直接檢查食品中的病原菌困難較大 實踐中，常用某些指示菌類的辦法來評定食品的衛(wèi)生質(zhì)量,60,表明食品被糞便污染和病原菌存在的指示菌應具備的特征： 指示菌必須與腸道致病菌密切相關； 指示菌對不良因素的抵抗力與病原菌大致相同； 指示菌與病原菌繁殖速度大致相同； 培養(yǎng)、分離、鑒定方法簡便，容易檢驗,61,1、大腸菌群（coliforms）,衛(wèi)生細菌領域用語 與糞便污染有關的細菌 定義： 一群在一定培養(yǎng)條件下可發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢

13、桿菌。,62,典型大腸桿菌為糞便近期污染的標志 其它菌屬則為糞便陳舊污染的標志,63,2、大腸菌群的食品衛(wèi)生學意義,作為食品被糞便污染的指示菌 MPN值愈低則說明食品受糞便污染程度及對人體健康危害程度愈低 作為食品被腸道致病菌污染的指示菌 大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高，但兩者之間并不總是呈平行關系 要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量,64,3、大腸菌群檢測方法與檢測結果,檢測方法： MPN計數(shù)法： LST發(fā)酵試驗 BGLB發(fā)酵證實試驗 平板計數(shù)法： VRBA平板計數(shù) BGLB發(fā)酵證實試驗 見GB/T4789.3-2010 檢測結果：用每1mL(g)樣品中大腸菌群最近似數(shù)來表 示，簡稱大腸菌群MPN。,65,LST發(fā)酵試驗,BGLB,VRBA平板,66,第三節(jié) 其他菌類數(shù)量的檢測方法,一、嗜冷菌數(shù)量測定 采用SPC法，在7培養(yǎng)10d觀察肉眼可見菌 適用于檢驗魚類、貝類等冷凍食品和低溫冷藏食品中的嗜冷菌,67,二、耐熱菌與芽孢數(shù)量的測定 耐熱菌：將少量樣品72處理15s后，與45左右的已溶化