1、組織化學(xué)技術(shù) 江蘇大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 盧小東,組織化學(xué)的基本概念： 組織化學(xué)：組織水平，對組織內(nèi)存在的各種物質(zhì)進行定性、定量以及其局部的和移動的部位分析的方法 免疫組織化學(xué)：基于抗原抗體反應(yīng) 酶組織化學(xué),疾病的病理學(xué)研究概括起來主要在基因和蛋白水平上進行的研究。 免疫組織化學(xué)方法主要用于基因蛋白質(zhì)水平表達的研究。 蛋白表達= 分布，定位，定量； 蛋白表達與與腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后關(guān)系等,材料： 抗體： 多克隆抗體：為針對多個抗原決定簇的抗 體，為產(chǎn)生抗體的動物血清或免疫球蛋白。 單克隆抗體：為一個B淋巴細胞分化增殖產(chǎn) 生的抗體，可識別有限的抗原決定簇，特異 性強。,顯示物： 酶標(biāo)反應(yīng)：

2、 堿性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP） AP與不同的底物（萘酚As-Mx、快藍、快紅）作用，可形成不同顏色的終產(chǎn)物。用新品紅（New fuchsine）顯色，可形成不溶于有機溶劑的紅色沉淀，不褪色。 辣根過氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物為DAB四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺，產(chǎn)生棕色沉淀，不溶于有機溶劑，不褪色。,熒光標(biāo)記：熒光素標(biāo)記抗體 異硫氰酸熒光素（Fluorescien isothioyarale, FITC）520530nm 四甲基異硫氰酸羅達明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC

3、） 620nm 四乙基羅達明（Teraethyle rhodamine B200, RB200）590600nm,膠體金： 指金的水溶膠（以微小粒子分散在水溶液中， 免疫電鏡觀察,主要方法： 直接法： 間接法：經(jīng)過了第二抗體放大效應(yīng),PAP法：以過氧化物酶和抗過氧化酶抗體形成復(fù)合物，通過第二抗體的橋接與第一抗體結(jié)合，然后以酶底物反應(yīng)檢出。,ABC法： 生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）為具有高度親合性的物質(zhì)，一個卵白素分子可結(jié)合4個生物素。當(dāng)生物素標(biāo)上特定的標(biāo)記物質(zhì)后or與抗體結(jié)合后仍能與卵白素結(jié)合，因此，將抗體結(jié)合上生物素，然后與卵白素和帶有特殊標(biāo)記物的生物素的結(jié)合反應(yīng)，而以適當(dāng)

4、方式顯示。,S-P法（LSAB）： 采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉素生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素（底物）混合液來測定細胞和組織中的抗原。,Envision： 原理：第二抗體上標(biāo)記有多聚物酶（HRP or AP）復(fù)合物與第一抗體結(jié)合。二抗上的多聚物可結(jié)合許多的HRP分子，使信號有顯著提高，敏感性較PAP法，ABC法高出幾十倍，背景因多聚物葡聚糖是人體內(nèi)不存在，無非特異性干擾，尤其是多聚物酶分子結(jié)合的第二抗體孵育時間短，該方法更省時，簡便。,以LSAB法為例簡單介紹染色步驟： 石蠟切片脫蠟水； 3%H202抑制內(nèi)源性過氧化物酶15min； 每張切片加10-20ul非免疫性動物血清，室溫孵育5

5、min； 加特異性一抗，370C孵育3060min，or 40C過夜； 加20ul生物素標(biāo)記的第二抗體，370C ，30min；,加過氧化物酶標(biāo)定的鏈菌素親生物素，370C，30min； 以上每步后均用PBS液洗33min； 用過氧化物酶基質(zhì)液（DAB基質(zhì)液）顯色515min。在光鏡下觀察。 自來水沖洗，蘇木素淺染，自來水沖洗還藍， 梯度酒精脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。,免疫組化常見問題的處理： 組織材料的處理： 固定液為：10%中性福爾馬林液； 4%多聚甲醛磷酸緩沖液（PH7.4）； 固定時間：8-24hr 組織大?。?*1.5*0.3cm,防脫片處理： 多聚-L-賴氨酸； 硫酸鉻

6、鉀明膠液。,增強特異性染色的措施和方法： 1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%）； b、胃蛋白酶消化（0.4%）。 2）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)： 方法：微波960C, 10min； 直接加溫方法 1000C, 10min； 高壓鍋 1200C, 10min； 熱處理液：0.01mol/L PH6.0 檸檬酸緩沖液,合適的抗體稀釋度： 過高，過低均會導(dǎo)致陰性結(jié)果。 即用型抗體； 濃縮型。,減少或消除非特異性染色的方法： 非特異性染色： 原因： 方法：,對照： 陽性對照：用一直抗原陽性的切片與待測標(biāo)本同時進行免疫細胞化學(xué)染色，陽性對照應(yīng)呈陽性結(jié)果，即為陽性對照。 陰性對照：用不含一直抗

7、原的標(biāo)本作對照，實驗結(jié)果為陰性，即為陰性對照。陰性對照中還包括空白對照、替代對照、吸收和抑制對照等，用以排除假陽性結(jié)果。,免疫組織化學(xué)的結(jié)果判斷應(yīng)非常嚴(yán)謹(jǐn)，陽性細胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細胞核型和細胞膜表面型。陽性細胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的依據(jù)。 陽性細胞的染色常定位于細胞，并于陰性細胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞，兩者可顯著區(qū)別。,陽性細胞的染色特征： 陽性細胞的染色分布有三種： 胞漿；細胞核；細胞膜表面 陽性細胞分布：灶性；彌漫性 染色強度不一 切片邊緣，刀痕or組織折疊，壞死，擠壓區(qū)，膠原結(jié)締組織等常表現(xiàn)為相同的

8、陽性染色強度。 對于陽性結(jié)果的定量判斷： -，+，+，+等分級和計數(shù)統(tǒng)計,淋巴細胞標(biāo)記物： 白細胞共同抗原（LCA, CD45）：主要分布于T, B細胞， 單核細胞，粒細胞表面。 CD20： B細胞標(biāo)記物。 CD45RO、CD3：T細胞標(biāo)記物。 CD57：為自然殺傷細胞的標(biāo)記物。 CD38：為漿細胞的標(biāo)記物。 CD68：主要標(biāo)記各種組織中的巨噬細胞。,神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物： 嗜鉻素A（Chromogranin, CgA）： 存在于神經(jīng)元，神經(jīng)內(nèi)分泌細胞及其腫瘤中。 突觸素（Synaptophysin, Sy）： 存在于神經(jīng)元突觸前囊泡膜上，腎上腺髓質(zhì)細胞， 神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中。 髓磷脂鹼性蛋白（My

9、elin basic protein, MBP）：,激素及激素受體類標(biāo)記： 雄激素受體（Androgen receptor, AR）： 雌激素受體（Estrogen receptor, ER） 孕激素受體（Progesterone receptor, PR）： 垂體激素： ACTH, GH, PRL, LH, TSH 主要用于垂體腺瘤的功能分類。 降鈣素（Calcitotin, CT）： 甲狀腺旁細胞（C細胞）分泌。,以上抗體及標(biāo)記物主要用于疾病的病理診斷和鑒別診斷 其聯(lián)合應(yīng)用的作用和意義： Keratin Vimentin 上皮性腫瘤 Keratin 滑膜腫瘤 Vimentin 間皮腫瘤 上

10、皮樣肉瘤 癌肉瘤,Desor Actin 肌源性腫瘤 CD34or F 血管性腫瘤 Keratin S-100or MBP 神經(jīng)鞘膜瘤 Vimentin LCA 淋巴細胞 AACT 骨腫瘤、纖維組織細胞腫瘤 GFAP 膠質(zhì)細胞腫瘤 Keratin NSEor Sy Vimentin NF 節(jié)細胞神經(jīng)母細胞瘤,免疫組化用于病理診斷及鑒別診斷原則： 免疫組化用于病理診斷及鑒別診斷，必須以HE染色的 形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，免疫組化只能作為輔助手段。不能把 免疫組化染色作為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。 免疫組化對良、惡性的判斷僅供參考。 免疫組化用于判斷組織起源，分型，預(yù)后的估計。 免疫組化染色不好或出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果時，以形態(tài)學(xué)為準(zhǔn)。,電子顯微鏡技術(shù)：透射電鏡,透射電鏡,掃描電鏡,電子顯微鏡技術(shù),透射電鏡,掃描電鏡,固定：為了盡量保存樣本的原樣使用戊二醛來硬化樣本和使用鋨酸來染色。 冷固定：將樣本放在液態(tài)的乙烷中速凍，這樣水不會