1、第三篇 應(yīng)用篇,分子診斷以DNA、RNA和蛋白質(zhì)為材料，通過應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，檢查基因的存在、結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常，從而對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷。 著重介紹感染性疾病、遺傳性疾病、復(fù)雜疾病等的分子診斷基本策略和方法。,分子診斷的臨床意義在于不僅能夠?qū)膊∽鞒鲈缙谠\斷、確切診斷，而且還能確定個(gè)體歸于疾病的易感性以及疾病的分期分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等。隨著分子診斷學(xué)的發(fā)展，分子診斷的原理和方法不僅適用于遺傳性疾病，而且也廣泛應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。 從生物中心法則來看，分子診斷包括檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)異常和基因表達(dá)異常。常見的分子診斷方法如下：,DNA,mRNA,蛋白質(zhì),轉(zhuǎn) 錄,反轉(zhuǎn)錄,翻

2、譯,PCR DNA測(cè)序 Southern-blot 基因芯片,基因結(jié)構(gòu)異常,基因表達(dá)異常,RT-PCR FQ-PCR Nothern-blot 基因芯片,ELISA Western-blot 組織化學(xué)染色 蛋白質(zhì)芯片,中心法則,檢測(cè)方法,第十四章感染性疾病的分子診斷,生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)科 2011.4,第一節(jié) 概 述,感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。 病原體：病毒、細(xì)菌、原蟲、支原體、 衣原體、立克次體。,常規(guī)檢測(cè)方法： 免疫學(xué)方法 微生物學(xué)方法 受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。,分子生物學(xué)方法：

3、 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 核酸雜交 基因芯片 早期、特異地進(jìn)行診斷，能提供病原體分型及耐藥性方面的信息，同時(shí)進(jìn)行大量基因的檢測(cè)。,一、感染性疾病的分子診斷，其診斷策略可以分為以下兩種：,一般性檢出策略，即只需要提供是否有某種病原體的感染； 完整檢出策略，即不僅對(duì)病原體做出診斷，還要進(jìn)行分型（包括亞型）和耐藥性方面的檢測(cè)。,1. 一般性檢出策略和方法,針對(duì)特異性的核酸序列進(jìn)行核酸分子探針雜交，或者利用常規(guī)PCR技術(shù)直接檢出微生物的DNA/RNA，它能夠判斷有無感染和是何種病原體感染。,2. 完整檢出策略和方法,按照診斷分型亞型耐藥性檢測(cè)的思路，利用多種分子診斷手段對(duì)感染性病原體進(jìn)行分析。 基因

4、芯片、基因測(cè)序等,二、感染性疾病分子診斷的常用方法,根據(jù)目的基因是否被放大， 可分為雜交法和擴(kuò)增法。 信號(hào)放大技術(shù)檢測(cè)方法 靶分子數(shù)目不變，而檢測(cè)的探針信號(hào)放大 采用多酶、多探針或二者結(jié)合等方法來增加探針標(biāo)志物的濃度使檢測(cè)信號(hào)得到放大。 靶分子擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法 靶分子（RNA、DNA或探針）的擴(kuò)增 PCR、替代擴(kuò)增、LCR等,分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA),nucleic acid sequence-based amplification (NASBA),Figure 1. Target generation scheme for SDA. This figure depicts the

5、 initial steps in an SDA reaction which transform the original target sequence into the amplification cycle depicted in Figure 2.,Figure 2. The SDA reaction cycle. These reaction steps continuously cycle during the course of amplification.,圖8-3 NASBA原理示意圖,引物A 5端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，3端堿基與靶RNA 3端序列互補(bǔ);引物B的堿基

6、序列與cDNA 3端序列互補(bǔ),三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理,標(biāo)本采集處理主要包括選擇合適的標(biāo)本種類、標(biāo)本量、抗凝劑等及對(duì)標(biāo)本進(jìn)行合適的傳送、保存和預(yù)處理。,四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋,1. 陰性結(jié)果 假陰性可能性 方法的靈敏度太低 方法失敗 目標(biāo)分子 2. 陽性結(jié)果 假陽性可能性 方法的特異性 受到污染,3. 定性檢測(cè)結(jié)果 有時(shí)不能提供病原體活力相關(guān)信息 臨床治療病情緩解后一定時(shí)間內(nèi)，在患者樣本中仍可以檢測(cè)出相應(yīng)的病原體。 有些病原體潛伏在進(jìn)體內(nèi)，沒有臨床癥狀。 4. 疾病狀況的判斷 檢測(cè)出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。 該病原體可能是一種正常菌群,五、感染性疾

7、病分子診斷的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià),用于感染性疾病治療的監(jiān)控和預(yù)測(cè)、病情發(fā)展過程的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)及疾病預(yù)后等。 耐用性的檢測(cè) 細(xì)菌的分型 流行病調(diào)查,第二節(jié) 病毒的基因檢測(cè),人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾病的75%左右。400多種不同病毒。 病毒結(jié)構(gòu)：大 ?。?0-300nm 核心區(qū)：核酸（DNA或RNA） 外周衣殼：蛋白質(zhì) 包膜：脂質(zhì)（鑲嵌有蛋白質(zhì)）,我國(guó)是HBV高流行區(qū)，50%70%的人受過感染，8%10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導(dǎo)致肝硬變，HBV又與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。 外殼（HBsAg): 外殼蛋白成分為表面抗原 核心（HBcA

8、g)： DNA DNA 聚合酶 HBcAg,一、 乙型肝炎病毒,Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài),完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米 由雙層外殼和一個(gè)核心組成的，核心直徑為27納米， 內(nèi)含DNA雙鏈和DNA多聚酶,（一）病毒基因組結(jié)構(gòu),3.2kb雙鏈DNA病毒 不完全雙連環(huán)狀DNA 長(zhǎng)鏈L為負(fù)鏈：有4個(gè)開放閱讀框S、C、P、X S區(qū)編碼外膜蛋白（HBsAg） C區(qū)編碼HBeAg 、HBcAg p區(qū)編碼DNA聚合酶 X區(qū)位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表 達(dá)有關(guān)。 短鏈S為正鏈：長(zhǎng)短不一,pre-s1,pre-s2,S,P,C,pre-c,X,HBV DNA 3.2 kb,pre-S1 pre-S1蛋白

9、pre-S2 pre-S2蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAg,HBV基因組結(jié)構(gòu),（二）分子診斷,常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，即二對(duì)半的檢測(cè)存在窗口期，不易早期診斷。 1.PCR 采用普通PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR，可提供直接、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷證據(jù)。引物是根據(jù)S、C、P、X基因中高度保守序列設(shè)計(jì)，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度。,擴(kuò)增位置 引物序列 擴(kuò)增片斷（bp) P、X基因 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 C基因 5-ATACCACAGAGTCTAGAC

10、TCGTGGTGGACT-3 477 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 C基因 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3,有時(shí)為了證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行以下分析： RLFP 斑點(diǎn)雜交 Southern雜交,2. 支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）,原理: 捕獲探針 檢測(cè) 靶探針1 體系 靶探針2 bDNA分子:DNA主鏈上結(jié) 合多個(gè)側(cè)鏈,捕獲探針固化在微孔板上 靶探針1分別與捕獲探針及待測(cè)核酸雜交 靶探針2分別與待測(cè)核酸及bDNA雜交 形成

11、復(fù)合物：,固相支持物,捕獲探針,靶探針1 CEs,待測(cè)核酸,靶探針2 LEs,bDNA復(fù)合物,分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA),信號(hào)檢測(cè)：bDNA可結(jié)合很多酶標(biāo)探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發(fā)光，使核酸信號(hào)放大，且發(fā)光強(qiáng)度與DNA量成正比。 優(yōu)點(diǎn)：放大倍數(shù)確定 陽性檢出率高 穩(wěn)定性和可重復(fù)性好 操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及,支鏈DNA技術(shù),3.基因芯片技術(shù) 標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后與芯片上的特異探針進(jìn)行雜交，可以檢測(cè)： 是否有病毒感染 感染病毒的種類及亞型 病毒的耐藥情況 特點(diǎn)：可同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè),近年來陸續(xù)上市的核苷(酸)類似物對(duì)HBV的治療壓力集中在P區(qū)。,干擾素

12、治療對(duì)HBV的壓力主要集中在前C/C區(qū)及前S區(qū)。,HBV耐藥突變,lamivudine,adefovir,entecavir,telbivudine,（三）臨床意義,1.早期診斷 免疫學(xué)檢測(cè)敏感性： 0.1g/ml 核酸雜交檢測(cè)敏感性：0.1pg/ml PCR檢測(cè)： 0.1fg/ml 因此，在感染早期即可通過DNA檢測(cè)證實(shí)病毒的存在。,2.監(jiān)測(cè)治療效果: HBVDNA107拷貝/ml提示病毒復(fù)制活躍； HBVDNA104拷貝/ml治療有一定療效； HBVDNA103拷貝/ml、HBeAg陰轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)氨酶正常為乙型肝炎臨床治愈指標(biāo)； 3.判斷病情，指導(dǎo)制定合理的治療方案,4.病毒耐藥性的檢測(cè) 乙肝病

13、毒DNA聚合酶YMDD處的突變是病毒產(chǎn)生耐藥性的重要原因，通過監(jiān)測(cè)YMDD的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信息，指導(dǎo)抗病毒治療。,二、流行性感冒病毒 流行性感冒病毒(Influenza virus)，是引起流行性感冒的病原體; 分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個(gè)型別; 根據(jù)病毒顆粒表面血凝素(Haemagglutinin ，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。 甲型流感病毒易發(fā)生變異，致病力強(qiáng)，1918年發(fā)生在西方國(guó)家的大流感殺死了幾千萬人， 即是由甲型流感病毒引起。,There are 16 different Hantige

14、ns(H1 to H16) and nine different N antigens (N1 to N9).,（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu) 單鏈RNA病毒，RNA為負(fù)鏈； 有8個(gè)RNA片段或7個(gè)RNA片段； 所有RNA片段5末端和3末端高度保守； 兩種不同亞型病毒感染宿主時(shí)，會(huì)生成基因重配的新病毒； RNA基因在復(fù)制過程中 常會(huì)發(fā)生點(diǎn)突變。,（二）分子診斷方法 可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測(cè)流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非結(jié)構(gòu)基因（NS）的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。 為證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性或提高檢測(cè)的靈敏度，可用限制性內(nèi)切酶分析法、斑點(diǎn)雜交法、Southern印跡法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。,

15、擴(kuò)增位置 引物序列 擴(kuò)增片段大小 NS基因 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190 (bp) 5-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3 NS基因 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241 (bp) 5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3,（三）臨床意義 流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，難以作出早期診斷。 PCR法敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學(xué)調(diào)查。,三. 人類免疫缺陷病毒（HIV),HIV，human immunodeficiency virus AIDS，a

16、cquired immunodeficiency syndrome HIV為艾滋病的病原體?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。 1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數(shù)為3.340萬，已死亡1.390萬，是全球十大主要死因之一。,最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；其內(nèi)為核衣殼。,2.基因組結(jié)構(gòu) 逆轉(zhuǎn)錄病毒，兩個(gè)拷貝的單股正鏈RNA； 每個(gè)RNA長(zhǎng)約9.7Kb，有5帽，3端有多聚尾； HIV是一種高度變異的病毒； 含有g(shù)ag、env 和 pol三個(gè)基因以及6種調(diào)控基因 tat, vif, vpr, vpx, nef, rev。,gag基

17、因編碼病毒的核心蛋白； pol基因編碼病毒復(fù)制所需要的酶類（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶）； env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學(xué)診斷的主要檢測(cè)抗原。 調(diào)控基因編碼輔助蛋白，調(diào)節(jié)病毒蛋白合成和復(fù)制。,（二）分子診斷方法,抗體的檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫熒光檢測(cè)法（IFA）；感染2周后才能逐漸產(chǎn)生病毒抗體； 抗原的檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)P24抗原，靈敏度低,1.病毒載量檢測(cè) 感染者體內(nèi)HIV的定量檢測(cè)，對(duì)病情判斷和治療效果檢測(cè)極有價(jià)值。 目前常用三種技術(shù)： RT-PCR 最低檢測(cè)限50拷貝/ml bDNA 最低價(jià)測(cè)限50拷貝/ml NASBA 最低檢測(cè)限20拷貝

18、/ml,PCR RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA整合到宿主基因組中復(fù)制，以被感染細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增； HIV為高變異病毒，不同患者體內(nèi)分離的病毒基因結(jié)構(gòu)有差異，引物設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)各編碼區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)； 靈敏度高，特別是用于無癥狀HIV感染者。,擴(kuò)增位置 引物序列 擴(kuò)增片斷（bp) gag基因 5-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3 342 5-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3 gap基因5-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3 115 5-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3 pol基因5-TAGAATTCCTCAGA

19、TCACTCTT-3 360 5-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3,核酸序列依賴的擴(kuò)增 NASBA Nucleic acidsequence-basedamplification NASBA原理: 將引物、標(biāo)本加入擴(kuò)增反應(yīng)液，65使RNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)打開,降溫至37加入逆轉(zhuǎn)錄酶,T7RNA聚合酶和RNaseH,并在37反應(yīng)11.5小時(shí),其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶。其主要產(chǎn)物為單鏈RNA, 用于RNA的擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序。,NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過程由三種 酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特

20、異性好。,2.病毒表型和耐藥檢測(cè),HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè) 最常用的耐藥檢測(cè)方法是基因型檢測(cè)方法, 即查找與病毒耐藥有關(guān)的基因突變。檢測(cè)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結(jié)果與已知的沒有發(fā)生突變的HIV（稱為野生株）基因序列進(jìn)行比較，與之不同的基因序列就認(rèn)為發(fā)生了突變。檢測(cè)出的任何突變都有可能導(dǎo)致形成HIV耐藥性，但具體結(jié)果的解釋必須要有非常有經(jīng)驗(yàn)的專家和醫(yī)師來進(jìn)行。,（三）臨床意義,1.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位； 2.PCR：可對(duì)無癥狀的感染者進(jìn)行早期診斷； 3.病毒載量檢測(cè)：在臨床進(jìn)展情況的判定及療效觀察上極有價(jià)值。,第三節(jié)：病原菌的

21、基因檢測(cè),概述 正常菌群：存在于人體表及與外界相通部位的細(xì)菌； 條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細(xì)菌； 病原菌：具有毒性和侵襲力的細(xì)菌，造成人體感染；,病原菌的診斷方法： 直接涂片法 生化試驗(yàn) 血清學(xué)試驗(yàn) 分離培養(yǎng) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測(cè)；,不能確診或進(jìn)行分型、耐藥性的檢測(cè)，或費(fèi)時(shí)等,全世界1/5人口感染，每年約300萬死于結(jié)核，中國(guó)占70%，免疫低下個(gè)體特別是HIV感染者更易于感染結(jié)核分枝桿菌。 結(jié)核分枝桿菌為革蘭氏陽性菌，細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性，對(duì)多種抗生素有抵抗力。,一. 結(jié)核分枝桿菌,形 態(tài),(一)基因組

22、結(jié)構(gòu) 1.TB H37Rv株基因組是環(huán)狀雙鏈DNA， 共有4 411 529bp; 2.共有4033基因，功能已知的有1734個(gè), 1694個(gè)可能為新基因; 3.基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶。,（二）分子診斷方法 普通PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR 擴(kuò)增靶序列： 65KDa抗原基因（細(xì)菌細(xì)胞壁上蛋白） MPB蛋白基因（結(jié)核桿菌復(fù)合群特有） rRNA基因 （種屬鑒定） ISDNA6110插入序列,靶序列 引物序列 擴(kuò)增片斷（bp） IS6110插入 5-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3 317 5-TCAGCCGCGTCCACGC

23、CGCCA-3 16SrRNA 5-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3 463 5-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3 DNA重復(fù)序列 5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3 245 5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3,TB耐藥檢測(cè),利福平耐藥-RNA聚合酶rpoB基因 異煙肼耐藥-katG基因 鏈霉素耐藥-S12的rpsL基因 16SrRNA的rrs基因 喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因 水解酶或藥物修飾酶（-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶和藥物外排系統(tǒng)等）,細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè),細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)、增加昂貴抗生

24、素的使用。 機(jī)理：由于細(xì)菌基因組的變異，導(dǎo)致 1.細(xì)菌細(xì)胞外膜通透性改變； 2.產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶，如-內(nèi)酰胺酶； 3.藥物作用靶位改變； 4.代謝途徑改變；,（三）臨床意義,1.準(zhǔn)確、快速、早期診斷TB 2.區(qū)分TB與其它分枝桿菌 3.疫情監(jiān)控和抗癆治療療效的評(píng)價(jià),二、 淋球菌,淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我國(guó)性傳播疾病種中，發(fā)病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現(xiàn)和流行對(duì)淋病的控制帶來很大困難。 傳播途徑：1.直接性接觸感染 2.間接接觸感染,（一）基因組結(jié)構(gòu) 1.染色體分子量980M，可編碼約5000個(gè)基因，GC含量為50%； 2.無操縱子結(jié)構(gòu) 3. 含有1至數(shù)個(gè)質(zhì)粒

25、（2.6MDa，24.5MDa），通過質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性在不同菌株間的轉(zhuǎn)移；,（二）分子診斷,1.PCR: 擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）,靶序列 引物序列 擴(kuò)增片斷（bp） CPPB基因 5-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3 633 5-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3 外膜蛋白5-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3 494 5-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3 5-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3,181,2.LCR（ Ligase chain reaction ）

26、連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.,原理：在PCR反應(yīng)體系中加入二條引物，加熱 (9495)使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65)，引物與模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果引物與模板完全互補(bǔ)，DNA連接酶即連接封閉缺口， PCR反應(yīng)接著進(jìn)行，擴(kuò)增出大量的目標(biāo)DNA.若有點(diǎn)突變，引物不能與模板精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接酶不能封閉缺口， PCR反應(yīng)不能進(jìn)行，無擴(kuò)增產(chǎn)物生成，據(jù)此可判斷模板DNA中有無突變.,（三）臨床意義 1.分子診斷技術(shù)具有靈敏性高、快速、特異性好的

27、優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)極微量的淋球菌。 2.應(yīng)用于以下幾方面： 對(duì)菌株進(jìn)行分型和耐藥性分析。 抗生素治療效果的觀察。 進(jìn)行流行病學(xué)分析。 對(duì)疑似病例的診斷和鑒別診斷。,第四節(jié) 衣原體的基因檢測(cè) 衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細(xì)菌濾器，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的一類原核生物。 沙眼衣原體是一種在人體內(nèi)長(zhǎng)期生存并又廣泛傳播的病原體，常導(dǎo)致人泌尿生殖道疾病及眼病，有15種血清型。,一、基因組 沙眼衣原體（血清型D）基因組大小1042Kbp，GC含量為41.3%，另有一個(gè)7493bp的質(zhì)粒，整個(gè)基因組有894個(gè)蛋白編碼基因，其中604個(gè)(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(gè)(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細(xì)菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(gè)(28%)在GenBank中沒有檢索到同源序列。,二、分子診斷 1. PCR 擴(kuò)增靶序列主要有