1、動(dòng)物細(xì)胞工程應(yīng)用,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞融合,單克隆抗體技術(shù),核移植,動(dòng)物細(xì)胞工程常用技術(shù),皮膚燒傷，如果創(chuàng)面很小（不大于硬幣）只要保持清潔，甚至深度燒傷，也可能自愈。如果下層真皮受損面積較大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自燒傷病人自身未燒傷的部位（自體植皮），也可取自其他活人或尸體（異體植皮）等。自體植皮是永久性的，取自其他人或動(dòng)物的植皮是暫時(shí)性的，是在創(chuàng)面愈合過程中為保護(hù)創(chuàng)面而采取的措施，1014天后就要被身體排斥。,如果一個(gè)大面積燒傷的病人來說，自體皮膚有限，其他渠道的皮膚來源不足。如何才能獲得大量的自體健康皮膚？,人耳鼠,“人耳鼠”再出風(fēng)頭 2001年，

2、一只特別的活老鼠在北京引起轟動(dòng)這是有著一對(duì)紅眼睛的、尾巴長長的、渾身沒毛的小白鼠。值得一提的是，這只小白鼠的背上，竟長著一只幾乎與身子一般大小的“人耳”。這只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民醫(yī)院副院長、整復(fù)外科主任曹誼林教授利用組織工程技術(shù)復(fù)制出來的。,在京展出的數(shù)天，盡管門票高達(dá)20元，但還是有將近20萬人，心甘情愿地掏錢一睹“人耳鼠”的風(fēng)采。,人耳鼠的出現(xiàn)，透露了怎樣的信息？,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù),一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),1.發(fā)展歷史: 20世紀(jì)初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細(xì)胞周圍的其他細(xì)胞融合而成的。生物學(xué)家們就這個(gè)問題展開了激烈的爭論。1907

3、年，美國生物學(xué)家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實(shí)驗(yàn)不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學(xué)家的不懈努力下，動(dòng)物組織培養(yǎng)不斷改進(jìn)并逐漸發(fā)展成為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。,2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念：,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長和增殖.,動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程,幼齡動(dòng)物,取動(dòng)物器官 和組織,剪碎組織,胰蛋白酶處理,細(xì)胞培養(yǎng),單個(gè)細(xì)胞,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)

4、的基礎(chǔ),剪碎組織的目的？,胰蛋白酶處理的目的？,3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程：,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,細(xì)胞懸浮液,胰蛋白酶,10代細(xì)胞,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),無限傳代,單個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)液,動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,（分解彈性纖維）,有關(guān)概念,原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。（分裝前的細(xì)胞培養(yǎng)） 傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。,有關(guān)概念,細(xì)胞株：傳代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到405

5、0代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。 細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。 細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別： 細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。,動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)要求,一 體外培養(yǎng)特點(diǎn): 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞要附在物體上表面生長，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)營養(yǎng)要求更嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖外，還需要血清。對(duì)環(huán)境適應(yīng)性差，對(duì)環(huán)境敏感，包括：PH、溶解氧、溫度、剪切力等比微生物要求更高。,二 培養(yǎng)工具:,培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管、多孔培養(yǎng)板等。,細(xì)胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主。 器皿應(yīng)選擇透明度好

6、、無毒、 中性硬度玻璃制品。,根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位。,三、培養(yǎng)條件細(xì)胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內(nèi)細(xì)胞基本相同。,【討論】 多細(xì)胞動(dòng)物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，討論以下問題： 1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物質(zhì)？ 提示：充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環(huán)境。 2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？ 提示：無菌、無毒的環(huán)境。,1）恒定的溫度:37 ，,維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.50.5

7、，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過39時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比； 人體細(xì)胞在39-401小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)； 在40-411小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)； 41-421小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能； 當(dāng)溫度在43以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。低溫下會(huì)使細(xì)胞代謝速率降低,2）PH：7.2-7.,當(dāng)PH低于6或高于7.6時(shí)的生長會(huì)受到影響，甚至死亡。 用來檢測(cè)PH的變化：紅色-pH7.4， 橙色-pH7.0，黃色-pH6.5，藍(lán)紅色-pH7.6，紫色-pH7.8。,

8、3) 氣體：,有調(diào)節(jié)PH的作用。 氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。,4）營養(yǎng)培養(yǎng)基：,在保證細(xì)胞滲透壓的情況下，培養(yǎng)液里的成分要滿足細(xì)胞進(jìn)行代謝所需要的各種營養(yǎng)，如包括十幾種必需氨基酸及其他多種非必需氨基酸、維生素、碳水化合物及無機(jī)鹽類等。只有滿足了這些基本條件，細(xì)胞才能在體外正常存活、生長。 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基一般分為天然、合成、無血清培養(yǎng)基幾種，此外細(xì)胞培養(yǎng)還需要一些常用的溶液。,合成培養(yǎng)基,1951年厄爾開發(fā)了供動(dòng)物

9、細(xì)胞體外生長的人工合成培養(yǎng)基(MEM)。合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的控制。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細(xì)胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。 人工合成培養(yǎng)基，如109培養(yǎng)液、DMEM、199、 RPMI-1640，IMEM，MEM培養(yǎng)液等。,天然培養(yǎng)基,直接采用取自動(dòng)物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。 血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)成分。它含有許多維持細(xì)胞生長繁殖和保持細(xì)胞生物學(xué)性狀不可缺少的未知

10、成分。 使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞碩利增殖生長。,常用的動(dòng)物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清分為胎牛血清和犢牛血清，前者來源少，價(jià)格高；后者要求剛產(chǎn)下尚未哺乳的小牛，因?yàn)椴溉楹蟮男∨Ｑ逯锌赡芎懈鼜?fù)雜的成分。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。,氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有12種是細(xì)胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液提供。激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、增殖刺激因子(MSA)、類胰島素生長因

11、子(IGFl、IGF2)等。 水解乳蛋白、膠原是另外兩種較好的天然培養(yǎng)基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成05溶液，微酸性。膠原是從動(dòng)物真皮中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長的作用。,無血清培養(yǎng)基,動(dòng)物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清對(duì)細(xì)胞生長很有效，但后期對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測(cè)造會(huì)成一定困難。另外高質(zhì)量的動(dòng)物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。 無血清培養(yǎng)基不加動(dòng)物血清，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長有效因子，激素等。,5) 細(xì)胞培養(yǎng)溶液,平衡鹽水（BSS）： Hanks 液和Earle液是常用

12、的BSS基礎(chǔ)溶液。 PH調(diào)整液： NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羥乙基哌嗪乙烷磺酸） 細(xì)胞消化液: 胰蛋白酶溶液EDTA溶液膠原酶溶液,抗生素溶液： 1)青、鏈霉素:每毫升培養(yǎng)液含100U青霉素和100ug鏈霉素. 2)卡那霉素：終濃度為50ug/ml培養(yǎng)液。 3）制霉菌素：濃度25U/ml，小瓶分裝，每瓶一次用完。,6)、無污染環(huán)境,培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。,四

13、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施,1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。 細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)實(shí)施原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。,細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室,1.準(zhǔn)備室 2.緩沖室,準(zhǔn)備室,風(fēng)淋,3.培養(yǎng)室,培養(yǎng)室,專用于組織細(xì)胞培養(yǎng)的空間，應(yīng)包括更衣間、緩沖間、操作間。 內(nèi)設(shè)超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱等細(xì)胞培養(yǎng)的必要設(shè)備，應(yīng)具備紫外消毒、通風(fēng)及溫控設(shè)施。 操作間放置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)及倒置顯微鏡等。

14、緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及毒好的無菌物品等,風(fēng)淋室： 風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。風(fēng)淋室的板壁采用輕質(zhì)隔熱夾芯鋼板，吹淋板采用進(jìn)口不銹鋼制作，吹淋口方向可調(diào)，風(fēng)淋時(shí)間可在30-99秒間的調(diào)整。風(fēng)淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35較為適宜。,超凈工作臺(tái),也稱凈化工作臺(tái)，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。,CO2培養(yǎng)箱,哺乳動(dòng)物離體細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞一樣,需要在恒足溫度下才能生存,溫差變化一般不應(yīng)超過0.5度，因此培養(yǎng)箱對(duì)溫度應(yīng)具有較高靈敏度。 C

15、O2培養(yǎng)箱的優(yōu)點(diǎn)在于能恒定地供應(yīng)一定量的CO2,一般5%即可維持培養(yǎng)液PH值穩(wěn)定。,冰箱,細(xì)胞培養(yǎng)的冰箱應(yīng)特別注意清潔，防止污染。,水純化裝置細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的質(zhì)量要求較高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各種培養(yǎng)用液。,過濾裝置,各種培養(yǎng)用液只能用過濾的方法進(jìn)行除菌消毒處理。微化濾膜濾器是目前應(yīng)用最廣泛的過濾裝置。,細(xì)胞冷凍貯存器 細(xì)胞冷凍貯存具有經(jīng)濟(jì)、省力和較好保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)，目前各實(shí)驗(yàn)室主要使用液氮容器貯存細(xì)胞。,培養(yǎng)器皿 培養(yǎng)器皿包括各種規(guī)格的玻璃、塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，吸管，離心管等。,洗刷消毒間： 烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。 分析間： 顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。,無菌操作

16、的要領(lǐng),由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的無菌，防止污染。 超凈工作臺(tái)消毒打開紫外線殺菌燈照射消毒2030分鐘，然后關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)，流入的空氣是經(jīng)過除菌板過濾的空氣，工作臺(tái)可保持無菌環(huán)境。 洗手 操作時(shí)因整個(gè)前臂伸入工作臺(tái)內(nèi)，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新潔爾滅或75%的酒精棉球擦拭。,火焰消毒,所使用物品均應(yīng)經(jīng)過燒灼，所用瓶口等開啟或封蓋時(shí)均需迅速旋轉(zhuǎn)過火焰進(jìn)行消毒。注意金屬器械不能在火焰上燒灼時(shí)間過長。 燒過的用具均要待冷卻后再接觸組織細(xì)胞。 吸取營養(yǎng)液后的吸管不能再經(jīng)火焰燒灼,否則會(huì)燒焦形成炭膜,再用時(shí)會(huì)將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液。,合

17、理布局 右手使用方便的用品放右側(cè)，左手使用方便的用品放左側(cè)。 酒精燈置于中央，打開的培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等應(yīng)保持斜立或平放（瓶口長時(shí)間開口直立,易增加落菌機(jī)會(huì)）。 吸取各種用液應(yīng)分別使用吸管，不能混用。,3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 的條件,1.無菌無毒的環(huán)境 2.營養(yǎng) 3.溫度和pH 4.氣體環(huán)境,應(yīng)該加入哪些物質(zhì)？這些物質(zhì)如何調(diào)配？,在使用合成培養(yǎng)基時(shí)通常需加入血清、血漿等天然成分，目的是什么？,4.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用,蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn) 如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體 健康細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)健康細(xì)胞用于燒傷病人皮膚移植 細(xì)胞的生理、藥理、病理研究 用于篩選抗癌藥物,植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,細(xì)胞

18、的全能性,細(xì)胞增殖,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,蔗糖 植物激素,葡萄糖 動(dòng)物血清,植物體,細(xì)胞株、細(xì)胞系,快速繁殖、培育無病毒植株,獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白,思考：,2、為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料？,1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？,3、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？,4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。獨(dú)特之處有：1、液體培養(yǎng)基 2、成分中有動(dòng)物血清等,因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng),成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于

19、培養(yǎng),不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體,動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體,一、動(dòng)物細(xì)胞融合,細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng),兩個(gè)細(xì)胞正在融合,受精作用,動(dòng)物細(xì)胞融合,細(xì)胞A,細(xì)胞B,雜種細(xì)胞,滅活的病毒,物理法 化學(xué)法,仙臺(tái)病毒 皰疹病毒 新城雞瘟病毒,用滅活的病毒誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過程,細(xì)胞融合與融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì),誘導(dǎo)劑：仙臺(tái)病毒 聚乙二醇 電融合 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的仙臺(tái)病毒必須滅活。,二、單克隆抗體,什么是抗體？ 抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。,B淋巴細(xì)胞與抗體,B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。 動(dòng)物

20、體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對(duì)特定的抗原具有特異性免疫作用。 每一個(gè)淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體。,單克隆抗體,由單個(gè)B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。 特點(diǎn)： 特異性強(qiáng)、靈敏度高,如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？,利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能 利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性 利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞 利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,單克隆抗體制備過程,細(xì)胞融合、篩選,足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群,單克隆抗體,思考：,1、本過程利用了哪些原理？

21、,免疫原理，細(xì)胞融合原理和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理,2、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？,這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體,單克隆抗體的應(yīng)用,與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。,應(yīng)用主要有：,1、臨床診斷,2、作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤,資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計(jì)的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個(gè)必然趨勢(shì)。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體

22、內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。,植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較,動(dòng)物的胚胎移植,解決某些妊娠時(shí)間長、每胎產(chǎn)子數(shù)量少的優(yōu)良種畜的繁殖速度問題。,胚胎移植技術(shù),試管動(dòng)物（嬰兒）培養(yǎng)過程,受精卵,一、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物,1、動(dòng)物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度不同,受精卵,胚胎干細(xì)胞,多能干細(xì)胞,單能干細(xì)胞,體細(xì)胞,核移植,胚胎細(xì)胞核移植,體細(xì)胞核移植（難度高）,2、動(dòng)物體細(xì)胞核移植是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核,移如入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中.使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎,這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。,3.培育過程,母體子宮,4、原理,動(dòng)物體細(xì)胞核具

23、有全能性,細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核,細(xì)胞核移植,多莉羊的培育過程,克隆羊的成功證明了什么？,1、動(dòng)物體細(xì)胞核具有全能性； 2、細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育的作用。,動(dòng)物體細(xì)胞核移植是一種無性繁殖技術(shù)，用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物。,其意義： 1、有利于遺傳疾病的治療，優(yōu)良品種的培育 2、對(duì)物種的優(yōu)化、瀕危動(dòng)物的保護(hù)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的擴(kuò) 群有重要意義 3、降低畜牧業(yè)的成本，縮短育種年限，提高生產(chǎn)效率,體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題：,許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷，免疫失調(diào)等。,動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)？ 分化潛能變窄：隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變窄，這是指

24、整體細(xì)胞而言。 細(xì)胞核仍具有全能性：細(xì)胞核，它含有保持物種遺傳性所需的全套基因，而且并沒有因細(xì)胞分化而丟失基因，因此高度分化細(xì)胞的細(xì)胞核仍具有全能性,根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞核仍具有全能性的特點(diǎn),怎樣將動(dòng)物細(xì)胞的全能性表達(dá)?,利用動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù),動(dòng)物核移植：,將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。,用核移植的方法得到的動(dòng)物。,克隆動(dòng)物：,多莉羊的培育過程,無性生殖,2.體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景,克隆動(dòng)物的研究意義,1.克隆動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白 2.改良動(dòng)物品種 3.治療人類疾病，作為供體 4.保護(hù)瀕危

25、動(dòng)物,體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題,1.許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。 2.成功率非常低及克隆動(dòng)物食品的安全性問題。,小結(jié),兩個(gè)過程,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程,單克隆抗體制備過程,三個(gè)“一”,一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法 滅活病毒,一個(gè)新細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞,一個(gè)優(yōu)勢(shì)單克隆抗體特異性 強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì),植物細(xì)胞工程,植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)和理論基礎(chǔ),植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是： 植物細(xì)胞的全能性,概念：細(xì)胞的全能性是指生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能。 原因：是生物體的每一個(gè)細(xì)胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)及發(fā)育為完整個(gè)體所必需的全部基因。,細(xì)胞的全

26、能性,當(dāng)植物細(xì)胞脫離了原來所在植物體的器官或組織而處于離體狀態(tài)時(shí)，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。,在生物的個(gè)體發(fā)育中，由于基因在特定時(shí)間和空間下選擇性地表達(dá)而形成不同器官，因此，要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的全能性，首先必須使生物體的細(xì)胞處于離體狀態(tài)。,植物組織培養(yǎng)的概念,植物組織培養(yǎng)就是在無菌和人工控制條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、叢芽，最終形成完整的植株。,植物組織培養(yǎng)的過程,離體的植物器官、組織或細(xì)胞,脫分化（又叫去分化）,愈傷組織（排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄

27、壁細(xì)胞）,再分化,根或芽等器官,植物體,二、植物組織培養(yǎng),植物組織培養(yǎng)過程,相關(guān)問題,1、在植物組培過程中，為什么要進(jìn)行一系列的消毒，滅菌，并且要求無菌操作？ 2、為什么切取胡蘿卜根的形成層，其他部分也能培養(yǎng)成小植株嗎？,植物體細(xì)胞雜交的概念,將不同種植物的體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的技術(shù)。 （不同種生物之間存在著生殖隔離，所以用傳統(tǒng)的有性雜交方法是不可能做到這一點(diǎn)的）,相關(guān)問題,（1）要想讓兩個(gè)來自不同植物的體細(xì)胞融合在一起，遇到的第一個(gè)障礙是什么？ （2）有沒有一種溫和的去細(xì)胞壁的方法？ （3）為什么兩個(gè)原生質(zhì)體能發(fā)生融合，這與細(xì)胞膜的什么特性有關(guān)？ （4）如果兩個(gè)來源不同的原生質(zhì)體發(fā)生融合形成了雜種細(xì)胞，下一步該對(duì)此細(xì)胞做何種處理？ （5）如何將雜種細(xì)胞培育成雜種植株？,植物體細(xì)胞雜交過程,雜合的原生質(zhì)體,雜種細(xì)胞,愈傷組織,雜種植株,植物體細(xì)胞雜交過程,原生質(zhì)體制備（酶解法去細(xì)