1、肺炎鏈球菌的分離和鑒定,衛(wèi)生部北京醫(yī)院 陳東科,概 述,肺炎鏈球菌（S.pneumoniae），俗稱肺炎球菌（pneumococcus）。經(jīng)常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成帶菌狀態(tài)。當機體免疫力下降時才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或嬰幼兒、老年體弱者易發(fā)生肺炎鏈球菌性肺部感染。,肺炎鏈球菌不產(chǎn)生外毒素，主要靠莢膜侵襲力致病。肺炎鏈球菌主要引起人類大葉性肺炎，肺炎后可繼發(fā)胸膜炎、膿胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻竇炎、支氣管炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和敗血癥等。,細菌學檢驗不僅對疾病的病原學診斷有重要價值，同時對臨床治療的藥物選擇也具有十分重要意義。,一、生物學性狀,1.

2、形態(tài)與染色,肺炎鏈球菌革蘭染色呈陽性。球形或矛頭狀，成雙排列，少呈鏈狀。在組織中可形成莢膜（人工培養(yǎng)莢膜逐漸消失），無鞭毛及芽孢。,2. 培養(yǎng)特點,（1） 培養(yǎng)基 肺炎鏈球菌對營養(yǎng)要求較高，需采用質(zhì)量好的哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)和新鮮血液（ 5馬血或羊血） 。 瓊脂濃度可適當下降至11.2，有利于肺炎鏈球菌的生長。,（2）分離培養(yǎng),1）標本處理 及時將采集標本接種到適當?shù)呐囵B(yǎng)基上是提高分離率的前提。因為，肺炎鏈球菌對干燥、對寒冷的抵抗力均較弱，在標本離開機體暴露于外界復雜的環(huán)境中，其存活率十分低，不及時接種適當培養(yǎng)基是導致分離率低的主要原因。,2）選擇性分離培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中添加5g/ml慶大霉素有利于

3、肺炎鏈球菌的分離。,3） 培養(yǎng)環(huán)境,510CO2、35培養(yǎng)2448h。,（3）肺炎鏈球菌的菌落形態(tài),在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，肺炎鏈球菌形成扁平、中間有凹陷的典型菌落，少數(shù)菌可呈粘液型菌落。,肺炎鏈球菌,肺炎鏈球菌,肺炎鏈球菌,3.抗原結(jié)構(gòu),（1）種屬特異性抗原：為菌體多糖抗原，存在于肺炎鏈球菌的細胞壁。 （2）型特異性抗原：是存在于肺炎鏈球菌莢膜中的一種多糖多聚體，可溶于水，據(jù)此抗原可將肺炎鏈球菌分為、等個型，其中、型致病性最強。 （3）菌體核蛋白抗原：存在于菌體深部，為蛋白質(zhì)，無特異性。,二、肺炎鏈球菌鑒定,肺炎鏈球菌的鑒定，主要應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌鑒別。其中以膽汁溶菌試驗、菊糖發(fā)酵和opto

4、chin試驗最為常用。必要時可作小鼠毒力試驗加以鑒別。在上述試驗中，肺炎鏈球菌均應(yīng)陽性，而甲型溶血性鏈球菌為陰性。必要時可用特異性單克隆乳膠或自動化儀器等相應(yīng)鑒定卡作鑒定。,肺 炎 鏈 球 菌 鑒 定 要 點,革 蘭 陽 性 雙 球 菌， 矛 頭 狀， 不 呈 鏈； 血 平 皿 菌 落 呈 草 綠 溶 血， 濕 潤， 菌 落 表 面 無 小 白 點； 培 養(yǎng) 時 間 長 出 現(xiàn) 臍 窩 狀； 膽汁溶解試驗陽性； 乳 膠 單 克 隆 抗 體 凝 集 陽 性。,口腔鏈球菌,1. 溶血性檢查,肺炎鏈球菌在厭氧或二氧化碳環(huán)境中溶血能力大大加強，草綠色溶血環(huán)很大，可與其他草綠色鏈球菌相區(qū)別。,2. Op

5、tochin(OP)敏感試驗,optochin即乙基氫化叩卟啉，因結(jié)構(gòu)似于奎寧，故又稱為乙基氫化羥基奎寧。該藥對肺炎鏈球菌的作用機制是干擾其葉酸的合成。 optochin敏感試驗方法似藥敏試驗。挑取被檢菌，密涂于血平板上，貼上含5g/片的optochin紙片，置510%CO2的大氣中（或燭缸），35孵育過夜。抑菌環(huán)直徑=14mm為敏感，推斷為肺炎鏈球菌。抑菌環(huán)直徑14mm時參照膽汁溶菌試驗。肺炎鏈球菌的抑制圈直徑常在20mm以上，甲型溶血性鏈球菌（約98%）小于12mm。,也有例外，我們在實際工作中檢出過耐optochin的肺炎鏈球菌，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的緩癥鏈球菌和部分口腔鏈球菌對optochin

6、的抑菌環(huán)直徑=14mm。應(yīng)注意鑒別。 但大多數(shù)肺炎鏈球菌對苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌對OX耐藥。這可作為輔助鑒別點。,2020/8/27,31,可編輯,肺炎鏈球菌,肺炎鏈球菌,3. 膽汁溶菌試驗,自溶酶是一種L-丙氨酸-N-乙酰胞壁酰胺酶，能切斷肽聚糖上L-丙氨酸與N-乙酰胞壁酸間的連接鍵，從而破壞細胞壁，使菌溶解。 自溶酶在菌生長的穩(wěn)定期被激活，也可被膽汁或膽鹽等活性物質(zhì)激活，從而促進培養(yǎng)物中的菌體溶解。肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗為陽性，甲型溶血性鏈球菌的膽汁溶菌試驗為陰性。,（1）試管法: 取新鮮培養(yǎng)物分裝于兩支試管內(nèi)（每支1ml），其

7、中一支加入10%的去氧膽酸鈉溶液0.1ml或純牛膽汁0.2ml，另一支加入無菌鹽水兩滴（對照），15min后，陽性者細菌被溶解，試管內(nèi)液體呈透明狀，陰性者無變化。,（2）平皿法: 加一滴10%的去氧膽酸鈉溶液或純牛膽汁于被檢菌菌苔上，15min后，陽性者細菌菌苔被溶解，陰性者無變化。試驗應(yīng)有已知肺炎鏈球菌作陽性對照。,膽溶陰性,4.乳膠凝集試驗,結(jié)果準確、快速、特異性高。,5. 莢膜腫脹試驗,取一滴抗血清與一滴菌懸液混勻，加少量美藍液混合后加蓋片，室溫1020min后，用油鏡檢查，如查到菌體呈蘭色，周圍繞有界限明顯未染色的膨大空白圈為陽性。可用于肺炎鏈球菌的分型。,6. 凝集試驗,包括血清凝集

8、試驗、SPA（葡萄球菌蛋白A）協(xié)同凝集試驗、反向乳膠凝集試驗等方法。,表1 非溶血鏈球菌的鑒別, 菌 種 Optochin 膽汁 膽 汁 6.5%NaCl 吡咯烷 衛(wèi)星現(xiàn)象 CAMP 血清群 敏 感 溶菌 七葉苷 肉湯 酮 酶 肺炎鏈球菌 + + 牛鏈球菌 + D 無乳鏈球菌 d + B 草綠色鏈球菌 營養(yǎng)變異鏈球菌 + + *d.不同菌株,三、肺炎鏈球菌的藥敏試驗,K-B法：采用Mueller-Hinton瓊脂5羊血培養(yǎng)基。直接菌落懸液法(0.5麥氏單位菌液，在15分鐘內(nèi)接種完)作為接種液。 稀釋法：包括瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法和Etest法。 培養(yǎng)條件：為35 、5CO2培養(yǎng)2024小時。質(zhì)

9、控菌株ATCC 49619。,1.肺炎鏈球菌的耐藥機制,青霉素G耐藥肺炎鏈球菌（PRP）的耐藥機制是肺炎鏈球菌有6種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）發(fā)生改變，因為PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位，改變后使PBP與青霉素G的結(jié)合力下降； 青霉素G耐藥肺炎鏈球菌（PRP）始發(fā)現(xiàn)于1967年； 多重耐藥肺炎鏈球菌（MDR）1977年首次在南非爆發(fā)流行。,肺炎鏈球菌對奎諾酮類抗生素的耐藥主要是由該菌產(chǎn)生拓撲酶所致。,肺炎鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機制主要為靶位的改變，即核糖體50S亞單位改變所致，由ersB(erythromycin resistance methyla

10、se)基因介導，其耐藥表型為MLS，即對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈陽霉素B交叉耐藥。另一耐藥機制為主動外排系統(tǒng)，由mefA基因介導，其耐藥表型為M，即對14元環(huán)（紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、地紅霉素、氟紅霉素）、15元環(huán)（阿奇霉素）大環(huán)內(nèi)酯類低水平耐藥，而對16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類（羅他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麥迪霉素、麥白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米歐卡霉素）、林可霉素和鏈陽霉素B敏感。,耐青霉素肺炎鏈球菌的傳播主要有兩種途徑: (1)克隆傳播，是耐藥菌株從一個國家或地區(qū)傳播到另一個國家或地區(qū)。 (2)基因水平轉(zhuǎn)移，是把耐藥基因轉(zhuǎn)移到敏感菌株中。 過度使用抗生素是耐藥菌株傳播的危險因素。一

11、般認為在抗生素的壓力選擇下，敏感菌株被殺死，耐藥菌株確能生存下來, 或者其他相關(guān)鏈球菌耐藥的DNA序列通過基因轉(zhuǎn)移在肺炎鏈球菌之間傳播。 研究發(fā)現(xiàn)證實兒童鼻咽部存在“隱匿性耐藥克隆株” 。 隨著我國兒童-內(nèi)酰胺類抗生素大量使用, 可以預計不久的將來, 不敏感的肺炎鏈球菌將會急劇增加。,2.耐青霉素肺炎鏈球菌的檢測,紙片擴散法對內(nèi)酰胺類藥物結(jié)果的準確性不夠，用1g/片苯唑西林(OX)篩選肺炎鏈球菌對青霉素耐藥時，當抑菌環(huán)直徑小于20mm時，就必須做稀釋法證實是耐藥。,3.肺炎鏈球菌的藥敏報告,用1ug/片苯唑西林紙片測試青霉素敏感性，當抑菌環(huán)20mm或MIC0.06ug/ml可報告青霉素敏感。并

12、同時可報告氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、亞胺培南、氯碳頭孢和美羅培南敏感而不需要再測定這些藥的敏感性。,肺炎鏈球菌的藥敏報告（續(xù)1）,當苯唑西林抑菌圈19mm時應(yīng)確定青霉素、頭孢噻肟或頭孢曲松的MICs，因為抑菌環(huán)19mm可以發(fā)生在青霉素耐藥、中介或敏感菌株中。,肺炎鏈球菌的藥敏報告（續(xù)2）,當從血液或腦脊液中分離出肺炎鏈球菌，應(yīng)常規(guī)報告MICs。測定的藥物應(yīng)包括青霉素、頭孢噻肟或頭孢曲松、美羅培南和萬古霉素。,4.肺炎鏈球菌感染的治療,青霉素G敏感均可直接用青霉素G進行治療; 青霉素G中度耐藥株可用大劑量青霉素G進行治療；