1、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及 常見(jiàn)問(wèn)題分析,張紹進(jìn),Western Blot簡(jiǎn)介 Western Blot一般流程 Western Blot常見(jiàn)問(wèn)題分析,Western Blot 簡(jiǎn)介：,印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。 1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。 而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電

2、泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。,Western Blot 基本原理,Western Blot 優(yōu)點(diǎn),高分辨率的電泳技術(shù) 特異敏感的抗原-抗體反應(yīng) 1-5ng中等大小的靶蛋白,Western Blot應(yīng)用,目的蛋白的表達(dá)特性分析 目的蛋白與其它蛋白的互作 目的蛋白的組織定位 目的蛋白的表達(dá)量分析,Western Blot 流程,蛋白樣品的制備 SDS-PAGE 轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗雜交 二抗雜交 底物顯色,通過(guò)有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白 水溶液提取法 針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。 有機(jī)溶劑提取

3、法 對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通過(guò)層析或電洗脫法制備目的蛋白,蛋白樣品的提取,蛋白樣品的定量,目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、 BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作，測(cè)定樣品濃度。 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的各種方法匯總： ,蛋白樣品的變性,2SDS-PAGE上樣緩沖液： DTT可臨用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20凍存。 按1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合，95100加熱515min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20

4、-25l，總蛋白量2050g。,SDS：,陰離子去污劑 變性劑 氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。 蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。 與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，使蛋白質(zhì)分子線性化。,蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)：,（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒（2）平均1g 蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS （3）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的 （4）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比,不連續(xù)的電泳緩沖體系。 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于

5、蛋白質(zhì)分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,SDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。 強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開(kāi)二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。 蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超 過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所 帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基 的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)。,【

6、SDS-PAGE基本原理】,凝膠成分,丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 SDS 配膠的Tris緩沖液 TEMED 過(guò)硫酸銨 Tris-甘氨酸電泳緩沖液,PAGE：聚丙烯酰胺凝膠,聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰 胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker) N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide， 簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強(qiáng)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和透明 度。是良好的電泳介質(zhì)。,聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：,單體：丙烯酰胺（Acr）； 交聯(lián)劑：甲

7、叉雙丙烯酰胺（Bis）； 催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素（AP）； 加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）； 產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠,聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過(guò)提供氧游離基(free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來(lái)完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（APTEMED）和光化學(xué)催化（核黃素TMTED）體系。,凝膠濃度與蛋白分離范圍,SDS-PAGE濃縮膠(5% Acrylamide)及分離膠配方表：,不連續(xù)電泳：,電泳緩沖液：pH8.3 Tris-甘氨酸系統(tǒng)。,灌制分離膠 隔絕空氣,ddH2O 0.1%SDS:8%,灌制積層膠 插入梳子,轉(zhuǎn)膜

8、,要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。 常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。,轉(zhuǎn)移膜的選擇,最常用于Western Blot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜的特點(diǎn)相似,主要用于核酸雜交。 各種膜的詳細(xì)特點(diǎn)介紹： ,濕轉(zhuǎn)系統(tǒng),半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng),麗春紅染色 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖

9、維素濾膜，換水幾次。 印度墨汁染色 只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探 針的Western印跡過(guò)程。,轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）,封閉,為避免作為檢測(cè)試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。 5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h） Western Blot 膜封閉液（生物試劑公司） Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。,一抗、二抗孵育,把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4過(guò)夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每

10、次10min。 加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4過(guò)夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。,二抗與底物反應(yīng)顯色,辣根過(guò)氧化物酶法（HRP） 堿性磷酸酶法（AP） 化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP),膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）,通過(guò)加熱和去污劑進(jìn)行解吸 原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。 酸解吸 原理：使用低pH改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點(diǎn)失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。,Western Blot結(jié)果分析,目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表

11、某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。 Western Blot結(jié)果分析軟件Gel-Pro Analyzer 4 綠色版（附動(dòng)畫(huà)演示教程）,Western Blot常見(jiàn)問(wèn)題分析,SDS-PAGE電泳,膠不平？ 凝膠漏液？,膠板洗刷干凈 加入AP和TEMED的量要合適 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻 兩塊玻璃板底部要對(duì)齊,條帶比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”條帶？,凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度 膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè),凝膠腫脹或卷曲？ 條帶歪斜或漂移？ 單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？ 轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？,可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min 電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。可在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙 確