1、第3節(jié)測定微生物的數(shù)量,學習導航 1.概述微生物計數(shù)的基本方法。 2.運用稀釋平板法測定樣品中微生物的數(shù)量。重、難點,一、直接計數(shù)法 1.常用方法：顯微鏡直接計數(shù)法。 2.具體步驟：將待測樣品制成懸液取一定量的懸液放在顯微鏡下進行計數(shù)觀察并計算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。,3.優(yōu)點 4.缺點：難以計數(shù)_的細菌。 5.適用范圍：一般適用于純培養(yǎng)懸浮液中各種_的計數(shù)。 二、間接計數(shù)法 1.常用方法：_。,所需設備_，可迅速得到結(jié)果 能觀察到微生物的_,簡單,形態(tài)特征,微小,單細胞菌體,稀釋平板計數(shù)法,2.具體步驟：需要將待測樣品配制成均勻的_并使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)過培養(yǎng)后，統(tǒng)計培養(yǎng)基中

2、出現(xiàn)的_,即可推算出檢測樣品中的活菌數(shù)。 3.優(yōu)點：在樣品中含菌數(shù)_的情形下也可以完成計數(shù)。,系列稀釋液,菌落數(shù),較少,判一判 (1)在用直接計數(shù)法測量培養(yǎng)瓶中酵母菌時，應在培養(yǎng)液靜置一段時間后，從瓶底部吸取液體樣本。() (2)用稀釋平板計數(shù)法，通過觀察菌落，得出的數(shù)值往往比實驗值要大。() (3)在計數(shù)時，用于培養(yǎng)的器皿要進行滅菌。(),三、間接計數(shù)法實例 1.土壤中好氣性細菌的計數(shù) (1)制備土壤稀釋液 取土壤表層_處的土樣。準確稱取1 g土樣，放入盛有_ mL無菌水的錐形瓶中，振蕩20 min后制成102倍的稀釋液。然后進行系列稀釋，得到103、104、105、106的系列稀釋菌液。,

3、5 cm10 cm,99,(2)取樣及倒平板：每個號碼設置_個重復。 (3)培養(yǎng)。 (4)觀察記錄 計數(shù)時對于細菌、放線菌、酵母菌以每個培養(yǎng)皿內(nèi)有_個菌落為宜。霉菌以每個培養(yǎng)皿內(nèi)有_個菌落為宜。,3,30300,10100,2.檢測天然水源中細菌總數(shù)和大腸菌群數(shù) (1)細菌總數(shù)通常是指1 g或1 mL檢測樣品中所含_的總數(shù),單位用cfu/g(mL)表示。,細菌菌落,(2)大腸菌群數(shù)通常是指每100 g或100 mL檢測樣品中所含大腸菌群的實驗數(shù)值，以(MPN)表示。大腸菌群是指在_條件下，24 h內(nèi)能發(fā)酵_，產(chǎn)酸產(chǎn)氣的一類_氧或_氧型革蘭氏陰性無芽孢桿菌的總稱。大腸菌群數(shù)的檢測，常用_法，使用

4、乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基、_瓊脂培養(yǎng)基(EMB培養(yǎng)基)和乳糖發(fā)酵管。,37,乳糖,需,兼性厭,多管發(fā)酵,伊紅美藍,3.土壤中分解尿素細菌的計數(shù) 有些細菌含有_酶，能將尿素瓊脂培養(yǎng)基中的尿素分解生成氨，氨溶于水變成氫氧化銨，導致培養(yǎng)基變成_性，使酚紅指示劑呈現(xiàn)_色。,尿素分解,堿,紅,想一想 土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱，為什么？ 【提示】由于土壤具備了各種微生物生長所需的營養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度等條件，是微生物生活的良好環(huán)境。對微生物來說，是微生物的“大本營”；對人類來說，是最豐富的“菌種資源庫”。,要點一直接計數(shù)法和間接計數(shù)法的比較 1.顯微鏡直接計數(shù)法 (1)原理：利用特定細

5、菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。,(2)方法：用計數(shù)板計數(shù)。計數(shù)板是特制的載玻片，其上有特定的面積為1 mm2，高為0.1 mm的計數(shù)室，一個計數(shù)室又被分成25個(或16個)中格，每個中格再被劃分成16個(或25個)小格，每個計數(shù)室都由400個小格組成。,(3)操作：將稀釋的樣品滴在計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計數(shù)45個中格中的細菌數(shù)，并求出每個小格所含細菌的平均數(shù)，再按計算公式求出每毫升樣品中所含的細菌數(shù)。 (4)計算公式 每毫升原液所含細菌數(shù)每小格平均細菌數(shù)40010000稀釋倍數(shù) (5)缺點：不能區(qū)分死菌與活菌。,2.間接計數(shù)法(活菌計數(shù)法)

6、(1)原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。,(2)操作 設置重復組,增強實驗的說服力與準確性。將待測樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.1 mL接種到已制備好的平板上，然后用無菌涂布器將菌液涂布在整個平板表面，放在適宜的溫度下培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)。為使結(jié)果接近真實值，可將同一稀釋度菌液加到三個或三個以上的平板上,經(jīng)涂布、培養(yǎng)，計算出菌落平均數(shù)。,為了保證結(jié)果準確，要選擇一個合適的稀釋倍數(shù)，且同一稀釋倍數(shù)的各個重復組菌落數(shù)要相近，若設置的重復組中結(jié)果相差太遠,意味著操作有

7、誤，需重新實驗。 (3)優(yōu)點：能觀察菌落特征。,在探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量變化的實驗中，需利用計數(shù)板對微生物細胞進行直接計數(shù)。計數(shù)板是一個特制的可在顯微鏡下觀察的載玻片，樣品就滴在計數(shù)室內(nèi)。計數(shù)室由2516400個小室組成，容納液體總體積為0.1 mm3。某同學操作時將1 mL酵母菌樣品加99 mL無菌水稀釋，用無菌吸管吸取少許使其自行滲入計數(shù)室，蓋上蓋玻片并用濾紙吸去多余菌液，進行觀察計數(shù)。,(1)在實驗中，某同學的部分實驗操作過程是這樣的：從靜置試管中吸取酵母菌培養(yǎng)液加入計數(shù)板進行計數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)；把酵母菌培養(yǎng)液放置在冰箱中；第七天再取樣計數(shù)，記錄數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析繪成曲線。 請糾正該同學實

8、驗操作中的3處錯誤： _ _；,_ _； _ _。 (2)在實驗前應該對計數(shù)板、吸管等器具進行_處理。,(3)如果一個小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清,應采取的措施是_ _。 (4)如果觀察到如圖所示a、b、c、d、e 5個大格共80個小室內(nèi)共有酵母菌48個，則上述1 mL酵母菌樣品中約有酵母菌_個；要獲得較為準確的數(shù)值，減少誤差，你認為該怎么做？_。,【解析】(1)在從試管中吸取酵母菌之前,應將試管輕輕振蕩幾次，目的是使酵母菌在培養(yǎng)液中均勻分布。酵母菌的培養(yǎng)液應置于適宜溫度下培養(yǎng)，并且每隔24小時就要統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。(2)為了避免雜菌污染，實驗中所用吸管、計數(shù)板等器具需進行滅菌處理。(3)、(

9、4)解答時要注意以下兩點:統(tǒng)一單位;注意體積的變化。,400個小室共容納液體總體積為0.1 mm3，則80個小室容納體積為：2102mm3，含酵母菌48個，又因酵母菌培養(yǎng)液總體積為100 mL,統(tǒng)一單位后即可求出酵母菌個數(shù)。,【答案】(1)應將試管輕輕振蕩幾次再吸取酵母菌培養(yǎng)液進行計數(shù) 應將酵母菌培養(yǎng)液放置在適宜溫度下培養(yǎng) 應連續(xù)七天，每天觀察、取樣計數(shù)并記錄數(shù)據(jù) (2)滅菌(3)適當稀釋 (4)2.4108多次計數(shù)，求平均值,變式訓練 用稀釋平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù),在對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是() A涂布了1個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230 B涂布了

10、2個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260，取平均值238,C涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163 D涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233,解析：選D。在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性，所以A、B兩項不正確。C項雖涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另兩個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地用3個平板的計數(shù)值求平均值。,要點二間接計數(shù)法在統(tǒng)計微生物數(shù)目時的注意事項 1.設置對照 (1)目的：排除實驗中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。

11、(2)方法：取一個未接種的培養(yǎng)基與接種好的培養(yǎng)基一起培養(yǎng)。,2.注意無菌操作 (1)建立無菌觀念，嚴格控制實驗器材、實驗室、實驗操作者的消毒、滅菌。 (2)整個實驗過程必須保證無菌操作。 (3)取樣、稀釋都要在酒精燈火焰附近的無菌環(huán)境中進行。 (4)規(guī)范操作，防止其他微生物污染，實驗結(jié)束后洗手、消毒。,3.準確計數(shù) (1)在計算結(jié)果時，不同的微生物要選擇的稀釋倍數(shù)不同。細菌、放線菌、酵母菌一般以每個培養(yǎng)皿中有30300個菌落為宜，而霉菌則以有10100個為宜。 (2)要設置3個或3個以上的重復組，然后求其平均值進行計算。 (3)每隔24 h統(tǒng)計一次，最后選取數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果。,特別提醒間接計數(shù)法主要是用來推測樣品中大約含有的活菌數(shù)。 統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比實際的數(shù)目低，因為當兩個或兩個以上微生物在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。,在做分離分解尿素的細菌實驗時，A同學從對應的培養(yǎng)基上篩選出大約150個菌落，而其他同學只選擇出大約50個菌落。A同學的結(jié)果產(chǎn)生原因可能有() 由于土樣不同由于培養(yǎng)基污染由于操作失誤沒有設置對照 AB C D,【