1、第四章 疏水層析,疏水層析亦稱疏水作用層析(hydrophobic interaction chromatography，HIC) 從分離純化生命物質的機制來看，它也屬于吸附層析一類。 疏水層析和反相層析(reversed phase chromatography)分離生命物質的依據(jù)是一致的，即: 視有效成分和固定相之間相互作用的疏水力差異性大小，將有效成分分離出來。,反相層析： 與基質結合的配體密度大，疏水性強，對蛋白質類物質具有較大的吸附力； 欲將吸附物解析下來，須用含有機溶劑的流動相(降低極性)洗脫，方可見效。 洗脫液的極性降低，常常會引起大分子活性物質變性， 因此反相層析一般較適合分離

2、純化小分子質量的肽類和輔基等物質。,疏水層析 (所用基質的性能與反相層析不同)： 與基質結合的配體密度小，疏水性弱，對蛋白質及其復合物僅產生溫和的吸附作用，吸附物容易被解析下來。 故，較適合分離純化鹽析后或高鹽洗脫下來的物質。 這不僅使有效成分的純度得到提高，而且還保持了其原來的結構和生物活性。,第一節(jié) 基本原理,一、疏水作用 就球形蛋白質的結構而言，其分子中的疏水性殘基數(shù)是從外向內逐步增加的。 一般球形蛋白和膜蛋白的結構均較穩(wěn)定，在很大程度上是取決于分子中的疏水性作用。,親水性強的蛋白質與疏水性固定相結合作用原理 一是:靠蛋白質表面的一些疏水補丁(hydrophobic patch)； 二是

3、:令蛋白質發(fā)生局部變性(可逆變性較理想)，暴露出掩藏于分子內的疏水性殘基； 三是:高鹽作用。疏水層析的特性所致，即在高鹽濃度下，暴露于分子表面的疏水性殘基才能與疏水性固定相作用(這與普通吸附層析和離子交換層析的操作是絕然不同的)。,一般在lmolL (NH4)2SO4 或 2molL NaCl 高濃度鹽溶液中，親水性較強的組分物質，會發(fā)生局部可逆性變性，并能被迫與疏水的固定相結合在一起， 然后通過降低流動相的離子強度，即可將結合于固定相的物質，按其結合能力大小，依次進行解吸附。,也就是：疏水作用弱(即親水性強)的物質，用 高濃度鹽溶液洗脫時，會先被洗下來。 當鹽溶液濃度降低時，疏水作用強的 物

4、質才會隨后被洗下來。 （相同鹽濃度下，疏水作用弱的物質先被洗下來 疏水作用強的物質隨后被洗下來） 對于疏水性很強的物質，則需要在流動相添加適量有機溶劑降低極性才能達到解吸附的目的。,二、吸附劑,固定相 由基質和配體(疏水性基團)兩部分構成。 配體對疏水性物質具有一定的吸附力。 基質則有親水性和非親水性之分。 親水性基質與（吸附疏水性物質的）配體構成的固定相，稱親水性吸附劑。 疏水性基質與（吸附疏水性物質的）配體構成的固定相，稱疏水性吸附劑。,1親水性吸附劑 基質主要是： 交聯(lián)瓊脂糖(Sepharose CL-4B) 配體是： 苯基或辛基化合物 基質與配體通過耦合方法構成穩(wěn)定的 苯基(或辛基)-

5、Sepharose Cl-4B吸附劑,2非親水性吸附劑 基質有： 硅膠、樹脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等 配體為：苯基、辛基、烷基(C4、C8、C18)等。 二者通過共價結合構成非親水性吸附劑。,第二節(jié) 操作與應用,一、層析柱的制備 1層析柱規(guī)格 所使用層析柱之規(guī)格與普通層析的相似 2固定相 在進行常壓疏水層析時，大多數(shù)是選用苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附劑作固定相。 苯基-Sepharose Cl-4B適合于分離純化與芳香族化合物具有親和力的物質。 辛基-SepharoseCl-4B則適用于分離純化親脂性較強的物質。,3裝柱 將選定的親水性吸附劑如苯基-Sepharose

6、C1-4B懸浮于乙醇溶液中，浸泡一段時間； 采用離心(或過濾)方法，棄上清液，收集沉淀物； 并以50(mV)濃度懸浮于樣品緩沖液中； 爾后，按常規(guī)方法裝入層析柱，經洗滌、平衡完畢，即可加樣。,二、加樣與洗脫,加樣前，在樣品溶液中要補加適量的鹽類。 (如上所述，加1molL(NH2)2SO4或2molLNaCl，以使樣品中的有效成分變性，并能與固定相很好地相互吸附。) 把此樣品溶液徐徐加入固定相(使有效成分與固定相之間作用0.5-1h)后，先用平衡緩沖液洗滌，再用降低鹽濃度的平衡緩沖溶液洗脫， 與此同時，要用部分收集器分段收集洗脫下來的溶液，并對收集的每部分溶液進行檢測。 固定相進行再生處理后可

7、重復使用。,三、應用實例,1純化雞胗鈣調蛋白 取新鮮雞胗(除去結締組織)切成1cm3小塊， 置組織搗碎機中，加2倍于固形物體積的緩沖液(50mmolL Tris-HCl，pH8.0，2mmolL EDTA，1mmolL-巰基乙醇)高速勻漿三次(30s次)， 離心(8000 rmin，4，0.5h)收集雞胗鈣調蛋白抽提液(沉淀重復抽提一次)，合并抽提液， 加硫酸銨鹽析(pH8.0，60飽和度)，除去大量雜蛋白， 上清液采用等電點沉淀(用H2S04調pH=4.0)，離心收集含有效成分的沉淀物， 加蒸餾水懸浮，用三羥甲基氨基甲烷(Tris)調pH=7.58.0，令其緩慢溶解， 經透析，離心得到溶液,上陰離子DEAE-Sephadex A50層析柱(pH8.0)（離子交換層析）， 用梯度緩沖液(10mmolLtris-HCl，pH8.0-0.2molL NaCl-1mmolL EDTA-1mmol