1、.,實(shí)驗(yàn)六 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),常祖明,.,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理 2.學(xué)會(huì)瓊脂糖凝膠的制作和進(jìn)行電泳的方法,.,實(shí)驗(yàn)原理,1.DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理,瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，在沸水中溶解，45開(kāi)始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小取決于瓊脂糖的濃度，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。,.,實(shí)驗(yàn)原理,（1）電荷效應(yīng) DNA分子在PH值高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電泳時(shí)向陽(yáng)極移動(dòng)。,.,（2）分子篩效益 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度主要取決于分子篩效益，即DNA分子本

2、身的大小和構(gòu)象（共價(jià)閉環(huán)DNA線狀DNA開(kāi)環(huán)DNA），而且其遷移速度與其相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比，所以不用相對(duì)分子質(zhì)量的DNA分子可以在瓊脂糖凝膠電泳中分離。,.,2. DNA分子進(jìn)行染色的原理（以溴化乙錠為例）,觀察瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖凝膠中的DNA分子。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí)，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入到DNA分子中的堿基對(duì)之間形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物在紫外光下發(fā)射的熒光要比單純的DNA分子要強(qiáng)的多，便于DNA的檢測(cè)。,

3、.,實(shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑,實(shí)驗(yàn)儀器及用具 電泳儀、移液槍、電磁爐、錐形瓶、容量瓶、紫外分析儀 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 實(shí)驗(yàn)材料：雞血DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物 DNA Marker 、GoldView核酸染色劑 、瓊脂糖、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 、硼酸 、乙二胺四乙酸二鈉、 6DNA LodingBuffer 實(shí)驗(yàn)試劑：0.5TBE（PH8.0）緩沖液 、1.0%瓊脂糖溶液、,.,實(shí)驗(yàn)步驟,瓊脂糖凝膠的配制,1g瓊脂糖,100mlTBE緩沖液,5l GoldView,冷卻到60,.,1.將適量的DNA Marker用移液槍加入凝膠的第一個(gè)孔中。 2.在PCR產(chǎn)物中加入6DNA LodingBuffer

4、（每5ul產(chǎn)物加入1ul），混勻后，用移液槍加入到樣品孔內(nèi)，每孔加2ul。,點(diǎn)樣,.,肉眼可見(jiàn)指示劑泳至距制膠板前端約2-3cm處即可停止電泳。切斷電源，取出凝膠，置于紫外線透射儀上觀察電泳結(jié)果，或用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存。,電泳、觀察,.,注意事項(xiàng),1.瓊脂糖融化時(shí)，檔位不宜太高。 2. 制膠和加樣過(guò)程中要防治氣泡的產(chǎn)生。 3. 操作過(guò)程必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。 4. 加樣時(shí)，Tip 頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或DNA 帶型不整齊。 5. 電源接通時(shí)，應(yīng)核實(shí)凝膠的方向是否正確。 6. 電泳儀有電壓顯示，并不一定標(biāo)志電泳槽已接通，應(yīng)觀察電極氣泡出現(xiàn)情況。負(fù)極的氣泡比正極多一