1、Chapter 7 Genome expression,1. 細(xì)胞核內(nèi)部 2. 染色質(zhì)修飾和基因組表達(dá) 3. DNA修飾和基因組表達(dá),內(nèi)容,1. 細(xì)胞核內(nèi)部,早期認(rèn)為，核內(nèi)結(jié)構(gòu)相對(duì)均一，即典型的通常論。 實(shí)際上，細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞質(zhì)同樣復(fù)雜，有著高度有序的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 唯一的不同的是，核內(nèi)不同的區(qū)域不存在明顯的膜結(jié)構(gòu)分隔，因此用傳統(tǒng)的光鏡和電鏡技術(shù)無(wú)法觀(guān)察到細(xì)胞核內(nèi)的各種功能性分區(qū)。,1.1 真核生物細(xì)胞核的內(nèi)部結(jié)構(gòu),A. 核內(nèi)部有著高度有序的內(nèi)部結(jié)構(gòu),細(xì)胞經(jīng)處理后，通過(guò)透視電鏡觀(guān)察：,真核生物核內(nèi)部結(jié)構(gòu)（人hela細(xì)胞的核基質(zhì)）,胞質(zhì)纖維,核與胞質(zhì)界限,核內(nèi)的纖維化網(wǎng)絡(luò),核基質(zhì)：蛋白質(zhì)和RNA纖維

2、組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。,帶有熒光標(biāo)記蛋白的活細(xì)胞核圖像,核仁,與RNA剪切相關(guān)的蛋白質(zhì)的位置,早期認(rèn)為，在真核細(xì)胞核內(nèi)的染色體是隨機(jī)分布的。 現(xiàn)在我們知道，這種觀(guān)點(diǎn)是不對(duì)的，在細(xì)胞核內(nèi)每一條染色體都占有自己的空間或地域。 這些分布可以用染色體涂染技術(shù)觀(guān)察到。,1.1 真核生物細(xì)胞核的內(nèi)部結(jié)構(gòu),B. 在核內(nèi)每條染色體都有自己的地域,通過(guò)染色體涂染觀(guān)察到的染色體地域,用代表單個(gè)染色體不同區(qū)域的混合DNA作為探針，進(jìn)行熒光原位雜交，可以顯示出每一條染色體所占據(jù)的區(qū)域。 這些區(qū)域占了核內(nèi)空間的絕大部分，但是被非染色質(zhì)區(qū)域分開(kāi)。 非染色質(zhì)區(qū)域包括了與基因組表達(dá)有關(guān)的酶以及其它各種蛋白質(zhì)。,染色體地域在每個(gè)

3、單獨(dú)細(xì)胞核內(nèi)是相對(duì)固定的。 但許多研究表明，在細(xì)胞分裂之后其相對(duì)位置是有變化的，在子代細(xì)胞核內(nèi)表現(xiàn)出不同的分布。 在區(qū)域定位上可能還是有些限制的，因?yàn)樵诎l(fā)生染色體易位時(shí)，某些染色體對(duì)間的易位要比其它染色體對(duì)間更為常見(jiàn)。研究表明，這些染色體對(duì)所在的地域通常比較接近。,1.1 真核生物細(xì)胞核的內(nèi)部結(jié)構(gòu),B. 在核內(nèi)每條染色體都有自己的地域,人的9號(hào)和22號(hào)染色體間的易位產(chǎn)物,易位后產(chǎn)生費(fèi)城染色體，可以導(dǎo)致慢性髓性白血病。,另一個(gè)富有爭(zhēng)議的話(huà)題是活性基因在每個(gè)染色體地域內(nèi)的定位。 早期認(rèn)為，活性基因一般位于各個(gè)地域的表面，便于接近非染色質(zhì)區(qū)域，這樣就可以接近參與基因轉(zhuǎn)錄的酶和蛋白質(zhì)。 現(xiàn)在研究結(jié)果表

4、明活性基因既在各個(gè)地域的表面，又在其內(nèi)部。 更細(xì)致的顯微觀(guān)察發(fā)現(xiàn)在染色體各地域之間有隧道貫穿，從而連接了非染色質(zhì)區(qū)域的不同部分。,染色體地域,原始模型,改進(jìn)模型,1. 細(xì)胞核內(nèi)部,染色質(zhì)是基因組DNA和染色體蛋白形成的復(fù)合體。 染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)是多層次的，存在著以核小體和30nm染色質(zhì)纖維為主的兩種最低包裝形式，有絲分裂中期的染色體是最高的壓縮形式。 通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察非分裂狀態(tài)的細(xì)胞核時(shí)，只能看到核內(nèi)是由著色深淺不同區(qū)域的混合體組成的。,1.2 染色質(zhì)區(qū)域,1. 細(xì)胞核內(nèi)部,深色區(qū)域稱(chēng)為異染色質(zhì)，即結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，包含無(wú)活性基因的染色質(zhì)。異染色質(zhì)可以分為兩類(lèi)： (1)組成型異染色質(zhì)：在所有細(xì)胞中永

5、久存在，DNA中基因含量很少，它包括著絲粒和端粒DNA以及某些染色體的部分特定區(qū)域。 (2)兼性異染色質(zhì)：無(wú)持久性特征，僅在部分細(xì)胞的部分時(shí)間出現(xiàn)，DNA中含有基因，這些基因在某些細(xì)胞中或細(xì)胞周期的某些階段失活。當(dāng)基因失活時(shí)，DNA就壓縮成異染色質(zhì)狀態(tài)。,1.2 染色質(zhì)區(qū)域,1. 細(xì)胞核內(nèi)部,一般認(rèn)為異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)是高度致密的，參與基因表達(dá)的蛋白質(zhì)不能接近DNA。 含有活性基因的染色體DNA區(qū)域則相對(duì)較疏松，可允許參與表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入，這些區(qū)域叫著常染色質(zhì)，它們?cè)谡麄€(gè)細(xì)胞核中分散存在。 常染色質(zhì)中，DNA主要以30nm染色質(zhì)纖維的形式存在，長(zhǎng)度介于40-100kb。 在此基礎(chǔ)上，DNA形成環(huán)狀

6、，通過(guò)富含AT的DNA片段即基質(zhì)結(jié)合區(qū)域（MAR）或稱(chēng)為支架附著區(qū)域（SAR）與核基質(zhì)相連。,1.2 染色質(zhì)區(qū)域,DNA在細(xì)胞核中組織的一種方案,核基質(zhì),基質(zhì)結(jié)合區(qū)域 支架附著區(qū)域,1. 細(xì)胞核內(nèi)部,連接在核基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)間的DNA環(huán)稱(chēng)為結(jié)構(gòu)域。 表達(dá)的基因周?chē)腄NA區(qū)域稱(chēng)為功能域。 功能域的DNA結(jié)構(gòu)較開(kāi)放，不致密。 脫氧核糖核酸酶I（DnaseI）是一種DNA結(jié)合蛋白，不能接近DNA致密區(qū)。用DnaseI處理一段純化的染色質(zhì)，可以界定功能域的范圍。,1.2 染色質(zhì)區(qū)域,在DnaseI敏感區(qū)域中的一個(gè)功能域,當(dāng)一個(gè)新基因插入真核生物染色體中時(shí)，如果基因插入高度包裝的染色體區(qū)域，基因?qū)⑹Щ?；?dāng)

7、插入開(kāi)放的染色體區(qū)域，基因?qū)⒈磉_(dá)，這就是位置效應(yīng)。,2. 染色質(zhì)修飾和基因組表達(dá),(1)染色體的某一個(gè)區(qū)段所表現(xiàn)出的染色質(zhì)包裝程度決定了位于該區(qū)段內(nèi)的基因是否表達(dá)； (2)當(dāng)一個(gè)基因位于開(kāi)放區(qū)域內(nèi)，可被其它蛋白質(zhì)接近時(shí)，其轉(zhuǎn)錄則受位于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物裝配區(qū)域的核小體的精確性質(zhì)和定位的影響。,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因表達(dá)的兩條途徑：,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因表達(dá)的兩種方式：,高度包裝的染色質(zhì),核小體有規(guī)則的間隔,核小體重新定位,便于DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合,2. 染色質(zhì)修飾和基因組表達(dá),真核生物基因組的活性主要取決于核小體，不僅因?yàn)楹诵◇w定位在DNA鏈上，還因?yàn)楹诵◇w內(nèi)組蛋白的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)是決定一段染色質(zhì)包裝程度

8、的主要決定因素。,2.1 組蛋白的化學(xué)修飾,A. 組蛋白乙?；绊懟蚪M表達(dá),組蛋白乙酰化：每個(gè)核心組蛋白N端的賴(lài)氨酸連上乙?；?。,四個(gè)核心組蛋白N端的賴(lài)氨酸結(jié)合乙?；?2.1 組蛋白的化學(xué)修飾,A. 組蛋白乙?；绊懟蚪M表達(dá),經(jīng)過(guò)修飾的N端從核小體核心八聚體中伸出，形成突出的尾巴。 它們的乙?；菇M蛋白對(duì)DNA的親和力降低，同時(shí)使30nm染色質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，降低了核小體間的相互作用，使DNA的結(jié)構(gòu)變得不致密，有利于基因的表達(dá)。 因此，異染色質(zhì)中的組蛋白一般不被乙?；?，而功能域中的組蛋白常被乙酰化。,核小體核心八聚體的兩種觀(guān)察結(jié)果,從頂部看,從側(cè)面看,H2A,H2B,H3,H4,N端尾

9、部,2.1 組蛋白的化學(xué)修飾,A. 組蛋白乙?；绊懟蚪M表達(dá),組蛋白乙?；窃诮M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase, HAT）的作用下進(jìn)行的。 單獨(dú)的HAT可以在試管中乙?；M蛋白，但在完整的核小體中卻不具備活性，這表明在核中HAT幾乎不能獨(dú)立工作，而是形成多蛋白質(zhì)復(fù)合物。如酵母的SAGA和ADA復(fù)合物，人類(lèi)的TFTC復(fù)合物。 這些復(fù)合物中包含很多蛋白質(zhì)，它們?cè)诨虮磉_(dá)起始過(guò)程中發(fā)揮各自的作用，組蛋白乙?；且粋€(gè)完整的部分，卻也只是基因活化這一整個(gè)過(guò)程的一部分。,2.1 組蛋白的化學(xué)修飾,A. 組蛋白乙?；绊懟蚪M表達(dá),HAT蛋白至少有5個(gè)不同的家族，它們都

10、和基因轉(zhuǎn)錄活化有關(guān)，同時(shí)還參與損傷DNA的修復(fù)，特別是紫外照射引起的雙鏈缺損的修復(fù)。 不同的復(fù)合物乙?；煌M蛋白，一些復(fù)合體還可以乙酰化與基因表達(dá)相關(guān)的其它蛋白質(zhì)，如一些通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIE和TFIIF。 總之，HAT蛋白功能多樣，參與了基因組的表達(dá)、復(fù)制和維持。,2.1 組蛋白的化學(xué)修飾,B. 組蛋白去乙?；种苹蚪M的活性區(qū)域,基因活性應(yīng)該是可逆的，否則被活化的基因?qū)⑹冀K保持激活狀態(tài)。 因此，存在一套能去除組蛋白末端的乙酰基團(tuán)的酶，即組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase, HDAC）。 HDAC活性與基因沉默間的聯(lián)系建立于1996年。 像HAT蛋白一樣，HDAC也被

11、包含在多蛋白質(zhì)復(fù)合體中。如哺乳動(dòng)物的Sin3和NuRD復(fù)合體。復(fù)合體中包含 HDAC1和HDAC2以及其它無(wú)去乙?；钚?，但對(duì)此過(guò)程提供必要輔助功能的蛋白質(zhì)。,2.1 組蛋白的化學(xué)修飾,C. 乙酰化不是唯一的組蛋白修飾類(lèi)型,賴(lài)氨酸的乙?；腿ヒ阴；茄芯孔顬樯钊氲慕M蛋白修飾形式，但不是唯一的類(lèi)型。還有三類(lèi)其它修飾： (1)組蛋白H3、H4的N端賴(lài)氨酸和精氨酸殘基的甲基化。盡管存在去甲基化酶，但是甲基化修飾還是相對(duì)長(zhǎng)期的。 (2)H2A、H2B、H3、H4的N端絲氨酸的磷酸化。 (3)H2A、H2B的C端賴(lài)氨酸的泛素化，即將泛素(ubiquitin)加到賴(lài)氨酸上，誘導(dǎo)其被26S蛋白酶體降解。,2

12、.1 組蛋白的化學(xué)修飾,C. 乙酰化不是唯一的組蛋白修飾類(lèi)型,像乙?；粯?，這些修飾方式也可以影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并對(duì)細(xì)胞活性具有重要影響，比如： 組蛋白H1、H3的磷酸化與中期染色體的形成有關(guān)； H2B的泛素化是泛素調(diào)控細(xì)胞周期功能的體現(xiàn)； H3的N端的第4和第9位賴(lài)氨酸殘基的甲基化效應(yīng)尤其有趣：第9位賴(lài)氨酸的甲基化可引發(fā)染色質(zhì)包裝并使基因表達(dá)沉默；但在第4位賴(lài)氨酸上加上2個(gè)或3個(gè)甲基之后，卻可促進(jìn)形成開(kāi)放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)基因活化。,2.1 組蛋白的化學(xué)修飾,C. 乙?；皇俏ㄒ坏慕M蛋白修飾類(lèi)型,總的來(lái)說(shuō)，4個(gè)核心組蛋白N端和C端共有29個(gè)位點(diǎn)可以被共價(jià)修飾。 隨著研究的深入，提示我們可能存在一

13、個(gè)組蛋白密碼（histone code）：即根據(jù)組蛋白被化學(xué)修飾的形式可以確定特定的基因組區(qū)域在特定時(shí)間的表達(dá)方式，還可以確定基因組生物學(xué)的其它方面，如損傷位點(diǎn)的修復(fù)，基因組的復(fù)制和細(xì)胞周期的協(xié)調(diào)等。,哺乳動(dòng)物組蛋白H3、H4的N端的修飾,19,Ac：乙?；?；Me：甲基化；P：磷酸化,2. 染色質(zhì)修飾和基因組表達(dá),第二種影響基因組表達(dá)的染色體修飾類(lèi)型是核小體重塑，即基因組的一個(gè)較短區(qū)域中核小體的修飾和重新定位，以便于DNA結(jié)合蛋白能夠接近它們的結(jié)合位點(diǎn)。 當(dāng)然這并不是對(duì)所有基因的轉(zhuǎn)錄都是必需的，在少數(shù)情況下，某些蛋白質(zhì)啟動(dòng)基因表達(dá)是通過(guò)結(jié)合到核小體表面實(shí)現(xiàn)的，并沒(méi)有影響核小體的定位。 在某些情

14、況下，核小體重新定位被明確地證明是基因激活的前提。,2.2 核小體重塑影響基因組表達(dá),hsp70基因的激活伴隨著DNA酶I高敏位點(diǎn)的形成,在黑腹果蠅中，在熱刺激情況下，GAGA蛋白激活hsp70的轉(zhuǎn)錄。,說(shuō)明該區(qū)域內(nèi)的核小體被移除了，有一段裸露的DNA暴露出來(lái)。,核小體重塑不像乙?；然瘜W(xué)修飾，它不涉及組蛋白分子的共價(jià)修飾。 核小體重塑由能量依賴(lài)的過(guò)程引發(fā)，以減弱核小體和與其結(jié)合的DNA間的聯(lián)系。此過(guò)程主要有3種改變： (1)重塑：嚴(yán)格意義上講，重塑只涉及核小體結(jié)構(gòu)的改變，比如核小體的體積變大，但并不改變位置。 (2)滑動(dòng)：或順式取代，即核小體沿DNA作物理移動(dòng)。 (3)轉(zhuǎn)移：或反式取代，即核

15、小體轉(zhuǎn)移到第二個(gè)DNA分子上或相同分子的非相鄰區(qū)域。,2.2 核小體重塑影響基因組表達(dá),重塑,滑動(dòng),轉(zhuǎn)移,核小體的重塑、滑動(dòng)及轉(zhuǎn)移,負(fù)責(zé)核小體重塑的蛋白質(zhì)與HAT一起形成一個(gè)大的復(fù)合體共同發(fā)揮作用，這提示核小體重塑可能和組蛋白乙?；嗯悸?lián)。這是一個(gè)誘人的假說(shuō)，因?yàn)樗鼘⒒蚪M活化中的兩個(gè)核心反應(yīng)聯(lián)系了起來(lái)。,3. DNA修飾和基因組表達(dá),DNA甲基化：在真核生物中，DNA中的胞嘧啶有時(shí)可由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶加入一個(gè)甲基而轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶。,3.1 DNA甲基化引發(fā)的基因組沉默,DNA甲基化在低等真核生物中較少見(jiàn)，但在脊椎動(dòng)物基因組中，高達(dá)10%的胞嘧啶都被甲基化，且僅限于5-CG-3序列中的胞

16、嘧啶；在植物中可高達(dá)30%，限于5-CNG-3序列中的胞嘧啶。 在細(xì)菌中，DNA甲基化可以避免被自身限制性?xún)?nèi)切核酸酶降解，并使這些內(nèi)切核酸酶作用于入侵的噬菌體DNA。,3.1 DNA甲基化引發(fā)的基因組沉默,3. DNA修飾和基因組表達(dá),目前已知存在兩種類(lèi)型的甲基化活性： (1)維持性甲基化：在基因復(fù)制之后，負(fù)責(zé)向新合成的鏈上對(duì)應(yīng)于親本鏈甲基化位點(diǎn)的位置添加甲基。維持性甲基化可確保兩個(gè)子代DNA分子保持與親本分子相同的甲基化模式。 (2)從頭甲基化：在新的位置添加甲基，從而可以改變基因組局部區(qū)域的甲基化模式。,3.1 DNA甲基化引發(fā)的基因組沉默,維持性甲基化和從頭甲基化都會(huì)導(dǎo)致基因活性的抑制。

17、 通過(guò)克隆將甲基化或非甲基化的基因引入細(xì)胞，檢查它們的表達(dá)水平，會(huì)發(fā)現(xiàn)甲基化的基因不表達(dá)。 當(dāng)檢查染色體DNA的甲基化模式時(shí)，也會(huì)發(fā)現(xiàn)具有活性的基因位于非甲基化區(qū)域。,3.1 DNA甲基化引發(fā)的基因組沉默,A. DNA甲基化和基因組活性的抑制,例如，人類(lèi)有40-50%的基因位于靠近CpG島的位置，CpG島的甲基化狀態(tài)反映了相鄰基因的表達(dá)模式。 那些在各種組織中都有表達(dá)的管家基因靠近未甲基化的CpG島，而組織特異表達(dá)的基因僅在其表達(dá)的組織中才是去甲基化的。,3.1 DNA甲基化引發(fā)的基因組沉默,A. DNA甲基化和基因組活性的抑制,DNA甲基化是如何來(lái)抑制基因表達(dá)的呢？ 下面提供一個(gè)模型：,DN

18、A甲基化和基因組表達(dá)之間聯(lián)系的模型,組蛋白去乙酰化酶復(fù)合體,被包裝的染色質(zhì),在Sin3和NuRD等組蛋白去乙?；笍?fù)合體中含有一個(gè)甲基化CpG結(jié)合蛋白（MeCP）組分，MeCP可以識(shí)別被甲基化的CpG島，并引導(dǎo)組蛋白去乙酰化酶復(fù)合體與甲基化了的CpG島相結(jié)合。,基因組印記：二倍體細(xì)胞核中同源染色體上的某一對(duì)基因中只有一個(gè)可以被表達(dá)，另一個(gè)因甲基化而沉默。成對(duì)基因中總是同一個(gè)基因被印記并因此失活；對(duì)一些印記基因來(lái)說(shuō)來(lái)源于母本，對(duì)另一些印記基因來(lái)說(shuō)來(lái)源于父本。 在人類(lèi)和小鼠中已有60多個(gè)基因顯示有印記現(xiàn)象，既包括蛋白質(zhì)編碼基因，也包括功能RNA基因。 印記基因在基因組中散布，但傾向于成簇發(fā)布。比如

19、：人第11號(hào)染色體1Mb的區(qū)段內(nèi)有8個(gè)印記基因。,3.1 DNA甲基化引發(fā)的基因組沉默,B. 甲基化參與基因組印記和X失活,人類(lèi)第11號(hào)染色體上的一對(duì)印記基因,父本,母本,Igf2，一種生長(zhǎng)因子，參與細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)。,90kb,印記基因,基因印記是由印記控制元件控制的。 印記控制元件是在印記基因簇幾千堿基內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的DNA序列，控制了印記區(qū)域的甲基化。 印記的功能：可能在發(fā)育中起作用。,3.1 DNA甲基化引發(fā)的基因組沉默,B. 甲基化參與基因組印記和X失活,X失活是印記一種特殊形式，它導(dǎo)致雌性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一條X染色體完全失活。 這種現(xiàn)象的發(fā)生是因?yàn)榇菩杂袃蓷lX染色體，而雄性只有一條。如果雌性的兩條X染色體都有活性，其蛋白質(zhì)合成的速率將是雄性的兩倍。 為了避免這種事件的發(fā)生，雌性的一條X染色體處于失活狀態(tài)，在核中呈現(xiàn)出一種致密的結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為巴氏小體，完全由異染色質(zhì)組成，其中80%的基因表達(dá)是沉默的。,3.1 DNA甲基化引發(fā)的基因組沉默,B. 甲基化參與基因組印記和X失活