1、.,質(zhì)粒DNA的提取和純化,.,基因工程,.,移液器和EP管,.,質(zhì) 粒,質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，獨(dú)立于染色體之外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸物質(zhì)。 質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性等。F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見(jiàn)的天然質(zhì)粒。 能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。 現(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過(guò)改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術(shù)中重要的工具。,.,分類： 單拷貝質(zhì)粒； 多拷貝質(zhì)粒； 緊密控制型； 松弛控制型；,.,.,質(zhì)粒DNA的提取方法,

2、堿裂解法； 煮沸裂解法； 酚氯仿抽提法；,概括起來(lái)主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理。,.,基本思路,培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增； 收集和裂解細(xì)菌； 分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需) 電泳檢測(cè)；,.,堿裂解法的基本原理,十二烷基磺酸鈉(SDS) 可使細(xì)胞膜裂解。 經(jīng)SDS處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。 當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circularDN

3、A，簡(jiǎn)稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)。 當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。,.,實(shí)驗(yàn)步驟,1、將含有質(zhì)粒的DNA細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。取1.5ml LB培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中，4下4000rpm離心5min。 2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。 3、菌體沉淀重懸浮于100l溶液中（需劇烈振蕩）。 4、加入新配制的溶液200l，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物（千萬(wàn)不要振蕩），冰浴2分

4、鐘。 5、加入150l預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，顛倒混勻，冰浴中5-10分鐘，4下12000g離心10分鐘。 6、上清液（450uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積的飽和酚（1:1），充分顛倒混勻，4下12000g離心10分鐘。,.,7、將水相（400uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積酚/氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心10min。 8、將水相（350uL）移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混勻后置于-20冰箱中20分鐘，然后4下12000g離心10分鐘。 8、棄上清，將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入0.5ml 70乙醇洗沉淀一次

5、，4下12000g離心10分鐘。 9、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。 10、將沉淀溶于10l TE緩沖液（pH8.0，含20g/ml RNaseA）中，儲(chǔ)于-20冰箱中。,.,LB液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani）,稱取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。,.,溶液I,50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液

6、可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲(chǔ)存于4冰箱,溶液I：重懸細(xì)菌； 葡萄糖：比重大，使細(xì)菌不易沉淀； TrisHCl：緩沖體系； EDTA：螯合金屬離子；,.,溶液,1mol/L NaOH 200l 10% SDS 100 l H2O 700 l,溶液II破膜，變性基因組DNA和蛋白質(zhì)； SDS破膜作用，解聚核蛋白并與蛋白質(zhì) 分子結(jié)合使之變性 ； NaOH(pH12)，破壞氫鍵，變性基因組DNA；,.,溶液,5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Ac5mol/L。,溶液III中和溶液，復(fù)性

7、質(zhì)粒DNA；,.,酚/氯仿（1:1）,酚變性蛋白質(zhì)； 氯仿萃取溶液中的酚；,分為兩層，上層為水層，下層為酚氯仿混合液。吸取時(shí)不要震蕩。,.,乙醇,無(wú)水乙醇（2倍體積）沉淀質(zhì)粒DNA； 70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，除去沉淀中的鹽分；,.,瓊脂糖凝膠,從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠后，剩下的不含磺酸基團(tuán)、羧酸基團(tuán)等帶電荷基團(tuán)的中性部分，結(jié)構(gòu)是鏈狀的聚半乳糖，易溶于沸水，冷卻后可依靠糖基間的氫鍵引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 凝膠的網(wǎng)孔大小和凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于瓊脂糖濃度。因此瓊脂糖凝膠可作為分子篩，常用于凝膠層析和電泳。,.,電泳,6loading buffer 2ml 樣品 10ml Marker 10ml 120V, 電泳3