1、實驗十一 植物組織總DNA的提取及DNA的濃度測定,掌握用CTAB法提取植物總DNA的方法和基本原理。 學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法測定DNA溶液的濃度。,一、實驗?zāi)康?二、實驗原理,通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細(xì)胞，由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。 CTAB, SDS等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。,再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因

2、核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入異丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于雙蒸水或TE溶液中，即得植物總DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到較純的DNA制劑。,DNA的吸收光譜峰在260 nm處，據(jù)計算，測定此波長下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時，雙鏈DNA含量約為50 g/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA含量。 由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280 nm處，在測定DNA含量時，還常計算OD260/OD280之值，如該值為1.8-2.0時，認(rèn)為已達(dá)到較高的純度，如低于此值，表明其內(nèi)含雜

3、質(zhì)較多，可能影響酶切反應(yīng)。,水稻品種的幼苗葉片,三、實驗材料,四、實驗器具、藥品試劑,水浴鍋，研缽，微量移液器，槍頭，離心管，臺式離心機，液氮，恒溫箱，標(biāo)簽紙，紫外分光光度計，磁力攪拌機，剪刀等。,2% CTAB抽提緩沖溶液，異丙醇, 氯仿-異戊醇等,CTAB法流程圖,五、實驗方法,(1) 2%CTAB抽提緩沖液在65水浴中預(yù)熱。 (2)取少量葉片（約0.2 g）置于研缽中，用液氮磨至粉狀； (3) 在液氮揮發(fā)將盡而植物組織尚未解凍時迅即加入700 l的2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動； (4) 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之二； (5) 置于65的水浴槽

4、或恒溫箱中，每隔10 min輕輕搖動，40 min后取出；,1. DNA的提取,（6）冷卻2 min后，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，劇烈振蕩23 min，使兩者混合均勻； （7）放入離心機中10 000 rpm離心10 min，與此同時，將600 l的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中； （8） 用移液器輕輕地吸取上清夜，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動30 sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；,（9）10000 rpm離心1 min后，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上； （10）60 sec后，直立離心管，加入720 l的

5、75%乙醇及80 l 5 M的醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中； （11）放置30 min，使DNA塊狀物的不純物溶解； （12） 10000 rpm離心1 min后，倒掉液體，再加入800 l 75%的乙醇，將DNA再洗 30 min；,（13）10000 rpm離心30 sec后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA（自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干）； （14）加入50 l 0.5 TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37恒溫箱約15 h，使RNA消解； （15）置于-20保存、備用。,稱取樣品，液氮研磨，加入預(yù)熱

6、的(65 ) CTAB及-巰基乙醇,保溫1h,期間不停的搖均,吸取上清液,移至新的離心管中,加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕緩顛倒混勻,10000rpm,10min,取上清液，移至新的離心管中,加等體積氯仿：異戊醇,顛倒混勻, 10000rpm,10min,取上清液，加入0.6-0.7V的異丙醇（預(yù)冷），后4 /-20 保溫沉淀,10000rpm,10min離心取沉淀，70%乙醇清洗兩次，吹干,用TE溶解DNA,然后低溫保存,取提取的DNA溶液2 l(約100-200 ng)至一干凈的離心管，加入198 l蒸餾水稀釋。先200 l蒸餾水至比色杯，進行紫外光空白測定，然后倒掉蒸餾水，加入200 l已稀釋的DNA溶液，測定260 nm及280 nm的光吸收值（OD260及OD280），計算DNA濃度及OD260/OD280比值。計算公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù) 以上濃度單位為g /ml,2. DNA濃度的測定,（1）葉片磨得越細(xì)越好。