1、重組DNA技術(shù) Recombinant DNA Technology,主要內(nèi)容,DNA重組技術(shù)(基因工程)的概念 DNA重組技術(shù)的原理 DNA重組技術(shù)的流程 DNA重組技術(shù)的應(yīng)用,又稱(chēng)分子克?。╩olecular cloning）或基因克?。╣ene cloning) 技術(shù)或 基因工程（genetic engineering）。 指在體外將DNA片段與載體連接，形成重組DNA分子，在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增或表達(dá)蛋白質(zhì)以及定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法及相關(guān)的技術(shù)。,第一節(jié) 概述,重組DNA技術(shù)概念,2. 簡(jiǎn)史,1972年, P. Berg 將猿猴病毒SV40的DNA和噬菌體DNA連接, 獲得構(gòu)建第一

2、個(gè)重組DNA分子 (1980年獲得Nobel 獎(jiǎng)); 1973年, S. Cohen首次將DNA片段與質(zhì)粒連接, 并轉(zhuǎn)化入E. coli; 1982年, 第一個(gè)基因工程產(chǎn)品-人胰島素(Ely LiLi公司), 在美國(guó)批準(zhǔn)上市。,Paul Berg Stanford University,基因重組生產(chǎn)人胰島素路線,人胰島素,第 二節(jié)重組DNA技術(shù)中常用的 工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶-“DNA剪刀” * DNA連接酶-“縫紉針” * 聚合酶：DNA聚合酶、DNA聚合酶I大片段（ Klenow片段）、Taq DNA聚合酶 DNA修飾酶：多核苷酸激酶、 堿性磷酸酶、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶） 反

3、轉(zhuǎn)錄酶,常用的工具酶,常用的工具酶,一、限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識(shí)別DNA的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶, 分為三型。,+,BamH,型限制性內(nèi)切酶，在基因工程技術(shù)中常用。特點(diǎn)：分子量小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)輔助因子，它們能識(shí)別雙鏈DNA的特異序列，并在這個(gè)序列內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段。 類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)為回文結(jié)構(gòu)，一般為46 bp（有些為8或8個(gè)以上堿基序列)，且富含GC。,第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)斜體； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)斜體； 第四個(gè)字母（

4、有時(shí)無(wú)）代表株（可大寫(xiě)或小寫(xiě)）； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,Hind ,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株的第3種酶,命 名,E=Escherichia，埃希氏菌屬 co=coli，大腸桿菌菌種 R=RY13，菌株名 I=第一個(gè)被分離到的內(nèi)切酶,EcoR I,基本特性,1. 具有特定的識(shí)別和切割位點(diǎn),識(shí)別位點(diǎn)舉例（切割位點(diǎn)）,2. 識(shí)別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（palindrome）,Bam H,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,3. 切割雙鏈DNA分子后產(chǎn)生黏端或平端,（sticky end）,（blunt end）,平齊切開(kāi),平齊切開(kāi),錯(cuò)位切開(kāi)

5、,平齊切開(kāi),來(lái)源與識(shí)別序列不同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏端，稱(chēng)為同尾酶。,Bam H,Bg l,+,+,4. 同尾酶（isocaudarner）,+,Bam H,+,Bst,+,Xma,+,Sma,來(lái)源不同但能識(shí)別同一序列（切割位點(diǎn)可同或不同）的兩種酶互稱(chēng)同裂酶。,5. 同裂酶（isoschizomer）,6. 切割會(huì)受其他因素的影響 限制性內(nèi)切酶通常不能切割在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)有特異堿基甲基化的序列。 緩沖液或環(huán)境溫度也會(huì)影響一些酶的特異性。 例如，EcoR I在正常情況下識(shí)別“-GAATTC-”序列，但在甘油濃度大于5%（v/v）或反應(yīng)溫度較低時(shí)識(shí)別序列可變?yōu)椤?AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT

6、嘧啶嘧啶-”，這種現(xiàn)象稱(chēng)為星號(hào)活性（star activity），以EcoR I*表示。,二、DNA連接酶,DNA連接酶（DNA ligase）：催化兩個(gè)相鄰的3-OH和5-磷酸基團(tuán)形成3，5-磷酸二酯鍵，從而使DNA片段或單鏈斷裂形成的缺口連接起來(lái)。,BamH I,1. 大腸桿菌染色體編碼的 DNA連接酶 需NAD+作為輔因子 2. 大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的T4 DNA連接酶需ATP作為輔因子,DNA連接酶的來(lái)源,三、其它常用工具酶,堿性磷酸酶能水解除去核酸分子末端的磷酸基團(tuán) 反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA 末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給DNA末端加尾以構(gòu)成黏性末端 DNA聚合酶I主要

7、用于合成DNA DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)保留了有用的酶活性 Taq DNA聚合酶常用于PCR 多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈5羥基末端磷酸化,來(lái)自于大腸桿菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或小牛腸（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于脫去DNA（RNA）5末端的磷酸基團(tuán)，使5-P成為5-OH，該過(guò)程稱(chēng)核酸分子的脫磷酸作用。,1. 堿性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基團(tuán),2. 反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄酶 （reverse transcriptase）,反轉(zhuǎn)錄酶催化的cDNA合

8、成,RNA,RNA,5,3,AAAAAA,AAAAAA,TTTTTT,5,3,cDNA,cDNA,隨機(jī)引物,Oligo-dT,5,3,5,5,3,3,5,3OH,GGG,GG,dGTP,末端轉(zhuǎn)移酶,3. 末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給DNA末端加尾以構(gòu)成黏端,大腸桿菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中常用的DNA聚合酶。其除具有53聚合酶活性外，還有35及53核酸外切酶活性。因其具有53核酸外切酶活性而常用于DNA探針的缺口平移法（nick translation）標(biāo)記。,4. DNA聚合酶I主要用于合成DNA,又稱(chēng)為Klenow片段（Klenow fragment）。

9、其保留了53聚合酶活性及3 5外切酶活性，失去了5 3外切酶活性。它具有的35外切酶活性能保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，即把DNA合成過(guò)程中錯(cuò)配的核苷酸去除，再把正確的核苷酸接上去（該活性稱(chēng)為校對(duì)活性）。 Klenow片段的主要用途有： 補(bǔ)齊雙鏈DNA的3末端，使其轉(zhuǎn)變成平端；或通過(guò)補(bǔ)齊3端而使3末端標(biāo)記； 在cDNA克隆中，用于第二股鏈的合成； 用于DNA序列分析。,5. DNA聚合酶I大片段保留了有用的酶活性,將黏端轉(zhuǎn)變成平端,G,C T T A A,OH 3,5,3,5,GA A T T,C T T A A,5,3,3,5,對(duì)5-黏端片段，利用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3-O

10、H端延伸，可填平末端的凹陷并將其轉(zhuǎn)變成平端。,DNA聚合酶,EcoR,將黏端轉(zhuǎn)變成平端,C T G C A,G,5,3,5,C,G,5,3,3,對(duì)3黏端的片段，應(yīng)用如T4 DNA聚合酶的35的 核酸外切酶活性可切去未配對(duì)的序列，將其轉(zhuǎn)變成平端。,核酸外切酶,Pst,5,3,6. Taq DNA聚合酶常用于PCR,Taq DNA聚合酶具有良好的聚合活性和熱穩(wěn)定性，常用于PCR。該酶具有53聚合酶活性及53外切酶活性，但沒(méi)有35外切酶活性，因而無(wú)35校對(duì)活性，故在PCR反應(yīng)中如果發(fā)生堿基錯(cuò)配，該酶沒(méi)有校正功能。針對(duì)此不足，目前研發(fā)出多種高保真耐高溫DNA聚合酶，大大降低了PCR過(guò)程中的堿基錯(cuò)配率。

11、 另外，Taq DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶作用，能在所合成DNA鏈的3末端加上一個(gè)單獨(dú)的腺苷酸殘基（A）。這樣的PCR產(chǎn)物可直接與帶有3-T的線性化載體（T載體）連接（即T-A克?。?7.多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈5羥基末端磷酸化,常用的是T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase），該酶含5多核苷酸激酶和3磷酸酶活性，能催化ATP的-位磷酸向DNA和RNA的5-羥基轉(zhuǎn)移。 該酶常用于： DNA或RNA的5末端標(biāo)記； 使沒(méi)有5-末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供連接和克隆之用。,第二節(jié) 目的DNA的獲取 Preparation of Interested DNA,一、化

12、學(xué)合成法可直接合成目的DNA,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 應(yīng)用：一般用于小分子肽類(lèi)基因的合成,* 化學(xué)合成法獲取目的DNA,由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列,色 苯丙 蛋 賴(lài),第一步：構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)（是指包含某一個(gè)生物細(xì)胞或組織全部基因組DNA序列的隨機(jī)克隆群體，以DNA片段的形式貯存了所有的基因組DNA信息）。 第二步：篩選含有目的基因的克隆。,二、從基因組DNA文庫(kù)中獲取目的DNA,組織或細(xì)胞染色體DNA,基因片段,克隆載體,重組DNA分子,含重組分子的轉(zhuǎn)化菌,限制性內(nèi)切酶或機(jī)械剪切,受體菌,基因組DNA文庫(kù): 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組

13、DNA片段的集合。,* 從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因,三、從cDNA文庫(kù)中獲取目的DNA,第一步：構(gòu)建cDNA文庫(kù)，即包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存了全部的基因表達(dá)信息。 第二步：篩選含有目的cDNA的克隆。,cDNA文庫(kù): 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有cDNA片段的集合。,基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,從基因組DNA文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中篩選目的DNA的策略 1. 菌落或噬斑原位雜交 2. 針對(duì)表達(dá)文庫(kù)，可用抗原-抗體或配體-受體結(jié)合的原理（親和篩選法）篩選,如果已經(jīng)知道目的基因的序列，通過(guò)

14、設(shè)計(jì)引物，就能很方便地用PCR反應(yīng)，從基因組DNA或cDNA中獲得目的基因，可不必要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的DNA或cDNA文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程。,四、經(jīng)PCR獲取目的DNA,第三節(jié) DNA載體 Vectors,載體（vector）是指可供插入或攜帶外源DNA，實(shí)現(xiàn)外源DNA在受體細(xì)胞中的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子 。,按功能分,克隆載體（cloning vector）,表達(dá)載體（expression vector）,按基本元件的來(lái)源不同,質(zhì)粒載體 噬菌體載體 黏粒載體 病毒載體 人工染色體載體等,概述,克隆載體(cloning vector)： 為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載

15、體稱(chēng)為克隆載體。 表達(dá)載體(expression vector)： 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為表達(dá)載體。,一、克隆載體,（一）克隆載體應(yīng)具備的主要特點(diǎn),至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)（origin of replication, ori） 至少有一個(gè)選擇性標(biāo)志（selection marker） 有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)：稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS） 應(yīng)有較高的拷貝數(shù),pBR322質(zhì)粒圖譜,1. 質(zhì)粒 (plasmid),特點(diǎn)：能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。,（二） 常用克隆

16、載體,嚴(yán)緊型質(zhì)粒: 質(zhì)粒與細(xì)菌染色體同步復(fù)制，處于 嚴(yán)密控制之下，其拷貝數(shù)較低。 松弛型質(zhì)粒: 質(zhì)粒的復(fù)制快于細(xì)菌染色體復(fù)制（即質(zhì)粒復(fù)制不受?chē)?yán)格控制），其拷貝數(shù)很高。重組DNA技術(shù)中使用的質(zhì)粒通常是松弛型。 不同的質(zhì)粒必須兼容才能共存于同一細(xì)胞中，這對(duì)復(fù)合轉(zhuǎn)染（或轉(zhuǎn)化）有參考價(jià)值。 目前，已有一系列商品化質(zhì)?？寺≥d體可供選擇，如pUC系列、pGEM系列等。 質(zhì)粒載體通常所能容納的外源DNA長(zhǎng)度在10 kb以內(nèi)，外源DNA片段越長(zhǎng)，質(zhì)粒越不穩(wěn)定。,噬菌體DNA改造系統(tǒng)： gt系列 EMBL系列,2. 噬菌體(phage),M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）： M13mp系列,3. 穿梭

17、載體（shuttle vector）,人工構(gòu)建，含有不止一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，能攜帶外源DNA序列在不同種類(lèi)宿主細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增。,表達(dá)載體是指用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外 源基因的載體； 依據(jù)其宿主細(xì)胞的不同可分為: 原核表達(dá)載體（prokaryotic expression vector） 真核表達(dá)載體（eukaryotic expression vector）,二、表達(dá)載體,具備克隆載體的一般特點(diǎn)外，還需有調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列等。原核表達(dá)載體的基本組成如下：,R：調(diào)節(jié)序列； P：?jiǎn)?dòng)子； SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列,大腸桿菌表達(dá)載體,（一）

18、原核表達(dá)載體,Lac啟動(dòng)子（乳糖啟動(dòng)子） Trp啟動(dòng)子（色氨酸啟動(dòng)子） Tac啟動(dòng)子（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子） PL和PR啟動(dòng)子（噬菌體的左向和右向啟動(dòng)子） T7啟動(dòng)子,啟動(dòng)子 是啟動(dòng)外源基因表達(dá)的必需元件，其能被RNA聚合酶 所識(shí)別，目前原核表達(dá)載體常用的啟動(dòng)子有：,2. SD序列提供核糖體結(jié)合位點(diǎn) mRNA在細(xì)菌中的翻譯嚴(yán)格依賴(lài)于核糖體結(jié)合位點(diǎn)的存在。SD序列（Shine-Dalgarno sequence）位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游813 bp處，為富含嘌呤的短片段，其能與核糖體30S小亞基中的16S rRNA 3端的部分序列互補(bǔ)結(jié)合。SD序列作為核糖體結(jié)合位點(diǎn)，保證了翻譯起始復(fù)合物的形成。

19、,3. 轉(zhuǎn)錄終止序列 有助于外源基因的高效表達(dá)。轉(zhuǎn)錄終止序列長(zhǎng)短不一，短的只有幾十bp，長(zhǎng)的可達(dá)幾百bp。 轉(zhuǎn)錄終止序列有助于使RNA聚合酶重點(diǎn)轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，控制所轉(zhuǎn)錄RNA的長(zhǎng)度，提高RNA穩(wěn)定性。 位于啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄終止序列可阻止其他啟動(dòng)子的通讀，降低本底；位于多克隆位點(diǎn)下游的轉(zhuǎn)錄終止序列可防止因外源基因表達(dá)而干擾載體的穩(wěn)定性。,4. 原核表達(dá)載體分類(lèi) 依據(jù)表達(dá)目的蛋白的方式，可將原核表達(dá)載體分為： （1）非融合型表達(dá)載體 （2）融合型表達(dá)載體 （3）分泌型表達(dá)載體,（1）非融合型表達(dá)載體 指不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起進(jìn)行表達(dá) 。,使用強(qiáng)啟動(dòng)子tac，緊接tac啟動(dòng)子的是多

20、克隆位點(diǎn)，目的基因克隆于啟動(dòng)子和SD序列下游。在多克隆位點(diǎn)下游包含一個(gè)很強(qiáng)的rrnB轉(zhuǎn)錄終止子，其作用是為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，因?yàn)樯嫌螐?qiáng)的tac啟動(dòng)子控制的轉(zhuǎn)錄必須由強(qiáng)終止子抑制，以免干擾與載體本身穩(wěn)定性有關(guān)的基因表達(dá)。載體的其余部分來(lái)自pBR322。,將一段特殊的蛋白質(zhì)（或短肽）的基因構(gòu)建入載體，使之與目的蛋白融合表達(dá)可形成融合蛋白（fusion protein）。 融合型表達(dá)載體，如pGEX系統(tǒng)。該系統(tǒng)載體使用強(qiáng)啟動(dòng)子tac，緊接啟動(dòng)子的是SD序列及其下游的GST基因，然后是多克隆位點(diǎn)。 用IPTG可誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物與GST融合，故可利用該標(biāo)簽對(duì)蛋白進(jìn)行純化。,（2）融合型表達(dá)載體,優(yōu)點(diǎn)：是

21、能把在受體細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的外源蛋白有效地分泌到周質(zhì)腔，甚至穿過(guò)細(xì)胞外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。 在構(gòu)建該類(lèi)載體時(shí)，除有一般表達(dá)載體應(yīng)有的啟動(dòng)子等元件外，還需含有編碼信號(hào)肽的序列（通常置于SD序列下游）。 可用于非融合蛋白的表達(dá)，也可用于融合蛋白的表達(dá)。 pIN 系列載體是較常用的分泌型表達(dá)載體，帶有大腸桿菌中最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一，即lpp（脂蛋白基因）啟動(dòng)子，其中編碼信號(hào)肽的序列取自大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompA （外膜蛋白基因）。,（3）分泌型表達(dá)載體,pIN 系列載體,（二）真核表達(dá)載體用于在真原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因,真核表達(dá)載體包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性基因、多克隆位點(diǎn)等。,真核表

22、達(dá)載體中還具有： 真核表達(dá)調(diào)控元件：包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、poly A 加尾信號(hào)等 真核細(xì)胞復(fù)制起始序列 真核細(xì)胞藥物抗性基因,OriPro：原核復(fù)制起始序列，可以在原核體系中擴(kuò)增；P：?jiǎn)?dòng)子；MCS：多克隆位點(diǎn)；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；Poly T：產(chǎn)生Poly A尾巴；orieuk：真核復(fù)制起始序列。注：不是所有真核表達(dá)載體都有整合序列,真核表達(dá)載體的基本組成,真核啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在不同類(lèi)型細(xì)胞中的活性差別很大。某些來(lái)源于病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，其真核宿主細(xì)胞范圍較廣，如Rous肉瘤病毒基因組長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeats，LTR）、SV40病毒早期基因的啟

23、動(dòng)子和增強(qiáng)子、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子等。這些啟動(dòng)子和增強(qiáng)子組合可在廣泛的宿主細(xì)胞中起作用，故在真核表達(dá)載體中被普遍使用。,真核表達(dá)載體帶有的poly A 加尾信號(hào)可保證新轉(zhuǎn)錄的mRNA能有效地加上poly A。 為 mRNA 加上 poly A 依賴(lài)于mRNA 3末端的AAUAAA和其下游的GU或U富含區(qū)。 盡管全長(zhǎng)cDNA克隆可能已帶有AAUAAA序列和一段poly A，但這些序列仍不足以保證poly A的有效形成。因此，載體中必須帶有poly A 加尾信號(hào)。 常用的來(lái)自SV40的poly A加尾信號(hào)為237 bp，其中同時(shí)含有針對(duì)早期和晚期轉(zhuǎn)錄子的切割和poly A 加尾信號(hào)。兩套

24、信號(hào)作用的方向相反，并分別位于不同的DNA鏈上，對(duì)mRNA的加工均很有效。,酵母表達(dá)載體 昆蟲(chóng)表達(dá)載體 哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體,根據(jù)真核宿主細(xì)胞的不同，真核表達(dá)載體可主要分為 ：,（1）酵母表達(dá)載體,根據(jù)載體在酵母細(xì)胞中復(fù)制方式的不同，可將酵母載體分為五類(lèi)： YIp：酵母整合型質(zhì)粒 YRp：酵母復(fù)制型質(zhì)粒 YCp：酵母著絲粒型質(zhì)粒 YEp：酵母游離型質(zhì)粒 YLp：酵母線性質(zhì)粒 除YLp外，其余各類(lèi)既可在大腸桿菌，又可在酵母細(xì)胞中復(fù)制與擴(kuò)增。,（2）昆蟲(chóng)表達(dá)載體,昆蟲(chóng)表達(dá)載體主要有兩類(lèi)： 桿狀病毒表達(dá)載體 啟動(dòng)子為多角體蛋白(polyhedrin)基因的啟動(dòng)子，所使用的外泌信號(hào)序列來(lái)自蜂毒素mili

25、ttin的序列，其可在宿主細(xì)胞（如Sf9或Sf20）中高水平表達(dá)外源蛋白。 果蠅表達(dá)載體 啟動(dòng)子有Ac5（果蠅黑素激動(dòng)蛋白5C基因）啟動(dòng)子和MT（果蠅黑素金屬硫蛋白基因）啟動(dòng)子，所使用的外泌信號(hào)序列為Bip序列，其可連續(xù)表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。,（3）哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體,據(jù)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式分為病毒載體和質(zhì)粒載體； 據(jù)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)是否整合于細(xì)胞染色體DNA，可將其分為整合型和非整合型載體； 整合型載體一般是隨機(jī)整合入染色體，但所攜帶外源基因的表達(dá)受插入位點(diǎn)的影響，同時(shí)還可能會(huì)改變宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，整合型載體通常用于外源基因的穩(wěn)定表達(dá)；非整合型載體通常用于外源基因的瞬時(shí)表達(dá)； 最常用的

26、哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體是病毒載體。,一個(gè)理想的病毒表達(dá)載體，應(yīng)具備以下條件：, 使用安全，對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒副效應(yīng)； 能容納較大的外源DNA片段且轉(zhuǎn)染效率高； 所產(chǎn)生的病毒效價(jià)高； 外源基因在靶組織或靶細(xì)胞中能長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá) 病毒的靶向性強(qiáng)； 外源基因的表達(dá)具有可控性。 到目前為止，還沒(méi)有任何一個(gè)病毒載體能滿足以上 全部理想條件。,病毒表達(dá)載體由各種病毒DNA衍生而來(lái)，其構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)放置其中，使病毒載體及其所攜帶的目的DNA能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞。 經(jīng)過(guò)質(zhì)?；慕ǖ牟《据d體通常都包括病毒啟動(dòng)子、包裝元件、遺傳標(biāo)記和質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)等幾個(gè)部分。,常用的病毒表達(dá)載體包

27、括如下多種：, 反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus, RV）載體 RV屬ssRNA病毒； 構(gòu)建RV載體時(shí)，將RV的DNA插入pBR322質(zhì)粒，同時(shí)刪除RV的三個(gè)編碼基因，保留兩端的LTR和病毒顆粒包裝序列，再加入供篩選的標(biāo)記基因。5LTR具啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性并具轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，3LTR具轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。 RV載體具有較高整合和表達(dá)外源基因的能力，廣泛用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因治療研究，但因其隨機(jī)整合，其安全性問(wèn)題需加以考慮。, 慢病毒（Lentivirus, LV）載體 LV載體是以HIV-1（I 型人類(lèi)免疫缺陷病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的表達(dá)載體； 與一般RV載體不同的是，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能

28、力； 該載體可將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而獲得持久表達(dá)； 該載體宿主細(xì)胞較廣，在表達(dá)目的蛋白和小干擾RNA方面都有廣泛應(yīng)用 。, 腺病毒（Adenovirus, AV）載體 AV屬線性dsDNA病毒； 目前，普遍使用的是AV第三代載體，載體中去除了所有AV的編碼基因，僅保留了5和3末端反向重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITR）及病毒包裝序列，病毒載體外殼的包裝需要輔助病毒提供編碼序列； 第三代AV載體能容納較大的DNA片段，能較長(zhǎng)時(shí)間地表達(dá)外源基因，其毒性和免疫原性都大大降低。, 腺相關(guān)病毒（adenovirus-associated virus，A

29、AV）載體 AAV屬于線性ssDNA病毒； 構(gòu)建AAV載體時(shí)，用外源基因及其調(diào)節(jié)序列取代病毒的rep和cap編碼區(qū)，僅保留兩端145 bp的ITRs，負(fù)責(zé)病毒的獲救、復(fù)制、包裝與整合；而輔助質(zhì)粒則保留所有編碼序列而無(wú)ITRs。兩種質(zhì)粒間無(wú)重復(fù)序列，重組AAV復(fù)制和殼化所需的rep和cap基因，由輔助質(zhì)粒直接以蛋白表達(dá)方式提供，故不會(huì)發(fā)生野生型病毒序列的重組、復(fù)制和包裝。當(dāng)AAV載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染輔助病毒（AV）感染的細(xì)胞時(shí)，即能獲救、復(fù)制并包裝成重組AAV 顆粒。 AAV載體具有能穩(wěn)定表達(dá)外源基因、特異整合至人的19號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端、病毒穩(wěn)定且宿主范圍廣、不引發(fā)免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn) 。, 痘苗病毒

30、（vaccinia virus，VV）載體 VV屬dsDNA病毒； 構(gòu)建VV載體時(shí)，通常以胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因作為篩選標(biāo)志。tk序列中插有該病毒的早期啟動(dòng)子和下游的多克隆位點(diǎn)。含有外源DNA的重組VV載體的tk基因不表達(dá)，當(dāng)與野生型VV共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并經(jīng)tk同源序列重組，便可獲得既有外源基因又有tk基因的重組VV顆粒，進(jìn)而導(dǎo)入tk缺陷的細(xì)胞后，可在含有次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基中篩選，只有tk表達(dá)的細(xì)胞才能生長(zhǎng)。 VV載體具有克隆容量大（可插入2540 kb的外源DNA片段）、可插入多個(gè)外源基因、病毒宿主細(xì)胞廣且使用較安全等優(yōu)點(diǎn)。, 猿猴空泡病毒40（s

31、imian vacuolating virus 40，SV40）載體 SV40的基因組為雙鏈環(huán)狀DNA 人工構(gòu)建的SV40載體主要有重組病毒質(zhì)粒載體和取代型重組病毒載體兩種類(lèi)型，前者是將SV40基因組復(fù)制起點(diǎn)序列插入質(zhì)粒載體中，從而構(gòu)建成病毒-質(zhì)粒載體；后者是用外源基因取代病毒基因組中與其大小相當(dāng)?shù)囊粋€(gè)片段，從而形成取代型重組病毒載體, 單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）載體 HSV為線性DNA病毒 構(gòu)建HSV載體時(shí)，通常由型HSV基因組改建而成 目前，HSV載體主要有兩類(lèi)，一類(lèi)是即刻早期（immediate early，IE）基因缺陷型載體，通過(guò)缺失這些IE基因

32、，降低了毒性，從而使外源基因表達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)；另一類(lèi)是利用該病毒的擴(kuò)增子（amplicons）制備的載體，該類(lèi)載體僅含有HSV復(fù)制起點(diǎn)和包裝序列以及調(diào)節(jié)序列。輔助質(zhì)粒為裝配型質(zhì)粒，其除了缺失包裝序列外，包含所有HSV基因組。兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，產(chǎn)生感染性重組病毒顆粒，其中僅含有HSV基因組序列，所有與毒性相關(guān)的HSV蛋白均以低水平表達(dá) HSV載體具有克隆容量大（可插入長(zhǎng)達(dá)50 kb的外源DNA）、外源基因可獲得穩(wěn)定表達(dá)、整合入宿主基因組后無(wú)致癌危險(xiǎn)、病毒宿主范圍廣且有較高的轉(zhuǎn)移效率和效價(jià), 其他病毒載體 除上述病毒載體外，目前用于構(gòu)建真核表達(dá)載體的病毒還有人巨細(xì)胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等。此外

33、，還有人試圖利用乙型肝炎病毒等構(gòu)建真核表達(dá)載體。,四、載體上的常用標(biāo)志或標(biāo)簽,通常用于重組子或陽(yáng)性克隆的篩選、鑒定； 常見(jiàn)的標(biāo)志有： 抗生素抗性基因 a.用于細(xì)菌重組子篩選的抗生素抗性基因 b.用于哺乳類(lèi)細(xì)胞陽(yáng)性克隆篩選的抗生素 抗性基因 酶的編碼基因 營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)志,標(biāo)簽（tag）：其編碼序列通常構(gòu)建于表達(dá)載體，與目的基因位于同一閱讀框內(nèi)，這樣就可使所表達(dá)的蛋白上帶上標(biāo)簽肽。 標(biāo)簽肽大小不等，小的只有幾個(gè)氨基酸殘基，大的有幾十kD。 標(biāo)簽肽常用于表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定。 常用的tag序列包括： His：68個(gè)組氨酸 FLAG：八肽序列 Strep：鏈親和素，八肽序列 HA：血凝素，九肽

34、序列 Myc：十肽序列 T7：11肽序列 S：14肽序列 HSV：11肽序列 VSV-G：11肽序列 GST SPA：葡萄球菌蛋白質(zhì)A MBP：麥芽糖結(jié)合蛋白 GFP：綠熒光蛋白 RFP：紅熒光蛋白 VSV：vesicular stomatitis virus，口蹄疫病毒,第四節(jié) DNA克隆的基本過(guò)程,目的DNA的分離獲?。ǚ郑?載體的選擇與準(zhǔn)備（擇） 目的DNA與載體連接（接） 重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)） 重組體的篩選與鑒定（篩）,DNA克隆的基本過(guò)程,基本步驟：,一、分離獲取目的DNA有多種方法（分）,DNA克隆的第一步是分離獲取目的DNA。 目的DNA的來(lái)源有多種，包括基因組DNA、經(jīng)

35、mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、化學(xué)合成法獲得的DNA等。,二、根據(jù)DNA克隆的目的選擇與準(zhǔn)備適宜載體（擇）,進(jìn)行DNA克隆的目的主要有二： 獲得目的DNA片段； 獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì) 針對(duì)第一種目的，通常選用克隆載體；針對(duì)第二種目的，需選用表達(dá)載體； 選擇載體時(shí)，還要考慮目的DNA的大小、受體細(xì)胞的種類(lèi)和來(lái)源等因素； 選擇載體時(shí)還需注意載體內(nèi)應(yīng)有適宜的多克隆位點(diǎn)。,不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞,三、目的DNA與適宜載體連接形成重組DNA（接）,（一）黏端連接為最適連接 1. 單一相同黏端連接會(huì)產(chǎn)生載體自連,單一相同黏端連接產(chǎn)生載體自連,單一相同黏端連接存在如下缺點(diǎn)：

36、 容易出現(xiàn)載體自身環(huán)化 目的DNA雙向插入載體（即正向和反向插入） 多拷貝現(xiàn)象 采用堿性磷酸酶預(yù)處理線性化載體DNA，使之去磷酸化，可有效減少載體自身環(huán)化 目的DNA如果反向插入載體，雖不影響基因克隆，但卻影響外源基因的表達(dá),Eco R切割位點(diǎn),Bg l切割位點(diǎn),2. 定向克隆可有效避免載體自連和DNA片段的反向插入,定向克?。簩⒋寺NA分子和載體分子采用同一對(duì)限制性核酸內(nèi)切酶切割后連接起來(lái)，可實(shí)現(xiàn)外源DNA片段的定向插入，此即定向克隆。,四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）,轉(zhuǎn)化（transformation） 質(zhì)?；蝠ち＜?xì)菌 （感受態(tài)細(xì)胞，competent cell） 質(zhì)粒酵母菌（真核細(xì)

37、胞） 轉(zhuǎn)染（transfection） 外源DNA真核細(xì)胞（酵母除外） 噬菌體DNA感受態(tài)細(xì)菌 感染（infection） 噬菌體顆粒細(xì)菌 病毒顆粒哺乳細(xì)胞,受體菌條件： 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)(competent),細(xì)菌的感受態(tài)（ competent bacterium）：細(xì)菌易于接納外源物質(zhì)的一種天然狀態(tài)，在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，為了分裂增殖的需要，細(xì)菌胞膜上會(huì)表達(dá)一些特殊的蛋白質(zhì)，利于外源物質(zhì)穿透胞膜，幫助細(xì)菌吸收外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。基因工程操作中，通過(guò)物理化學(xué)的方法也可使細(xì)菌處于感受態(tài)。處于該狀態(tài)的細(xì)菌被稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞。,將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的常用方法：,化學(xué)法：氯化鈣

38、化學(xué)轉(zhuǎn)化 物理法：電擊法、顯微注射法 等,用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化：,電擊法,顯微注射法,五、篩選與鑒定重組DNA有多種方法（篩）,一般一個(gè)載體只攜帶某一段外源DNA，一個(gè)細(xì)胞只接受一個(gè)重組DNA分子。最后培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體。將目的重組體篩選出來(lái)就等于獲得了目的序列的克隆。 篩選與鑒定程序主要包括：先篩選出帶有載體的克隆；然后篩選鑒定出帶有重組載體的克??；最后篩選鑒定出帶有目的DNA的克隆。 主要篩選和鑒定方法有遺傳標(biāo)志篩選法、序列特異性篩選法、親和篩選法等。,（一）用載體上的遺傳標(biāo)志可快捷方便地進(jìn)行篩選,1. 利用抗生素抗性標(biāo)志可篩選出帶有載體的重

39、組子 將含有某種抗生素抗性基因的載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，將細(xì)胞在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無(wú)載體轉(zhuǎn)入的細(xì)胞將被殺死，生長(zhǎng)的細(xì)胞即是含有載體的細(xì)胞。至于細(xì)胞中的載體是否為含有目的DNA的重組載體，尚需進(jìn)一步鑒定。,抗藥性標(biāo)志篩選,抗性平板,2. -互補(bǔ)篩選：利用了-半乳糖苷酶功能互補(bǔ)的基因片段。 -互補(bǔ)：pUC、pGEM及M13mp等載體系列均攜帶-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸殘基（片段）的編碼序列，在該序列中含有多克隆位點(diǎn)；經(jīng)過(guò)改造的宿主菌基因組DNA含有-半乳糖苷酶C端（片段）的編碼序列。只有當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)共表達(dá)該酶的和片段時(shí)，才能形成有活性的-半乳糖苷酶，該現(xiàn)象稱(chēng)為-互補(bǔ)（alpha

40、 complementation） 。 -半乳糖苷酶可在誘導(dǎo)劑IPTG存在的情況下，使底物X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色產(chǎn)物，使細(xì)菌克隆或噬斑呈藍(lán)色。當(dāng)外源DNA片段插入載體的多克隆位點(diǎn)后，便不能表達(dá)片段，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后不能分解底物，結(jié)果使菌落或噬斑呈現(xiàn)白色。因此，-互補(bǔ)篩選又稱(chēng)藍(lán)-白篩選 。,-互補(bǔ)篩選（藍(lán)-白篩選）,（二）根據(jù)序列特異性可篩選出特定的重組DNA,根據(jù)序列特異性進(jìn)行篩選的方法包括： 限制性內(nèi)切酶法 PCR法 核酸雜交法 DNA測(cè)序法等,限制性內(nèi)切酶法 針對(duì)初篩為陽(yáng)性的克隆，提取其重組DNA，以合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳便可判斷有無(wú)DNA片段的插入及插入片段的大小。同時(shí)，根

41、據(jù)酶切位點(diǎn)在插入片段內(nèi)部的不對(duì)稱(chēng)分布，可用該方法鑒定DNA片段的插入方向；進(jìn)而可用多種限制酶制作和分析插入片段的酶切圖譜。,限制性內(nèi)切酶圖譜分析,目的序列插入載體會(huì)使載體DNA限制性內(nèi)切酶圖譜（restriction map）發(fā)生變化，如插入的目的序列中有其他限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，也能在酶切電泳圖譜上觀察到。,2. PCR法 利用序列特異性引物，經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，可直接檢測(cè)目的DNA的存在，可鑒定出陽(yáng)性克隆。 如果利用克隆位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，再結(jié)合序列分析，便能可靠地證實(shí)插入片段的方向、序列和閱讀框的正確性。,3. 核酸雜交法 菌落或噬斑原位雜交（in situ hybridizait

42、on）。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的不同，可通過(guò)放射自顯影、化學(xué)發(fā)光、酶作用于底物顯色等方法來(lái)顯示探針的存在位置（即陽(yáng)性克隆的存在位置）。常用于從文庫(kù)中篩選目的DNA。,菌落或噬斑原位雜交,4. 核苷酸序列測(cè)定 主要有雙脫氧鏈末端終止法和化學(xué)降解法，尤其以前者最為常用。 針對(duì)已知序列，通過(guò)測(cè)序可明確序列和閱讀框的正確性；針對(duì)未知序列，可明確序列順序，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。 是最準(zhǔn)確的鑒定目的DNA的方法 。,第五節(jié) 常用的表達(dá)體系 Expression Systems,一、原核細(xì)胞表達(dá)體系,原核表達(dá)體系主要以細(xì)菌作為宿主細(xì)胞，包括大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌、沙門(mén)氏菌、蘇云金桿菌等，其中又以大腸桿菌表達(dá)體系應(yīng)用最為廣泛和最成熟。原核表達(dá)體系既可用于原核基因表達(dá)，也可用于真核基因表達(dá)。,大腸桿菌 (Escherichia coli) 遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表 達(dá)載體種類(lèi)齊全，表達(dá)效率高； 不具備真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng)，真核基因 在大腸桿菌中會(huì)合成錯(cuò)誤空間構(gòu)象的多肽鏈， 易形成包涵體(無(wú)正確折疊的立體結(jié)構(gòu))； 無(wú)真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，如糖基化、磷 酸化修飾等。,枯草桿菌 (Bacillus subtil