1、,長(zhǎng)春花 組織培養(yǎng),長(zhǎng)春花的價(jià)值,長(zhǎng)春花的組培進(jìn)展,我們的實(shí)驗(yàn)情況,長(zhǎng)春花的花語(yǔ)： 快樂，回憶，青春常在，堅(jiān)貞,長(zhǎng)春花組培的前景展望,植物名稱：長(zhǎng)春花 學(xué)名：Catharanthus roseus (L.) Don 科目：夾竹桃春花屬 別名： 日日春、日日新、日春花、四時(shí)春、五瓣梅、雁來紅 原產(chǎn)地：馬達(dá)加斯加、印度，現(xiàn)有許多園藝栽培種。,多年生草本植物,觀賞價(jià)值：,長(zhǎng)春花姿態(tài)優(yōu)美，花期特長(zhǎng)，適合布置花壇、花境。可用于城市園林地被，也可用于室內(nèi)盆栽觀賞,藥用價(jià)值：,迄今已經(jīng)從中提取分離出100多種例如長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、 文多靈、長(zhǎng)春質(zhì)堿、阿瑪堿、蛇根堿等生物堿。其中,長(zhǎng)春花 堿、長(zhǎng)春花新堿具顯著

2、的抗癌作用,阿瑪堿可防治冠心病,蛇根 堿為鎮(zhèn)痛藥。 又含有肌醇、琥珀酸、黃酮等其它化合物。 因此，藥理方面具有抗腫瘤、降壓、降血糖、利尿以及止 血、抗菌等作用，具有很高的藥用價(jià)值。 目前主要從天然植物中提取長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿，但是它們 在植物體中的含量極其微小，僅為百分之幾至十萬分之幾， 化學(xué)合成和半合成也不太理想。因此通過長(zhǎng)春花的組織培養(yǎng)、 細(xì)胞培養(yǎng)等的一系列工作來獲取有效成分，才能更好地進(jìn)行 長(zhǎng)春花的研究與開發(fā)，從而挖掘更大的市場(chǎng)潛力。,研究進(jìn)展,基本培養(yǎng)基與外植體的選擇,以前的實(shí)驗(yàn)中有人先后在B5、White、Wo-L、WoNiKO5-L培養(yǎng)基上均誘導(dǎo)出長(zhǎng)春花愈傷組織，且在其上的繼代培養(yǎng)也

3、獲成功?，F(xiàn)在常用MS培養(yǎng)基,鄭宗坤等（2001）,在MS+10椰子汁培養(yǎng)基上，以長(zhǎng)春花的葉柄為外植體誘導(dǎo)率最高，嫩葉次之，而嫩莖和嫩根最差，不能作為誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳外植體,長(zhǎng)春花組織培養(yǎng)條件的最優(yōu)化,細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞培養(yǎng)物中藥用成分含量的影響因素,長(zhǎng)春花作為特殊的藥用植物，其組織培養(yǎng)具有特殊的目的，其中誘導(dǎo)產(chǎn)物的藥用成分含量是我們所關(guān)注的主要問題之一。長(zhǎng)春花組織培養(yǎng)及細(xì)胞生長(zhǎng)和生物堿的合成受內(nèi)部機(jī)制與外部環(huán)境共同調(diào)控，培養(yǎng)基組成、光、溫度、pH值、外源激素、前體物質(zhì)、誘導(dǎo)子、培養(yǎng)方式等都有影響。,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) 在培養(yǎng)基的各組分中，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)堿最有影響的因素之一是植物激素。在長(zhǎng)春花組織培養(yǎng)中

4、，常用激素有2,4-D，激動(dòng)素(KT)，萘乙酸(NAA)，芐基腺嘌呤(6-BA)。,郭勝娟（2004） 在長(zhǎng)春花的細(xì)胞培養(yǎng)與組織快繁的實(shí)驗(yàn)中得出不同種類、不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)具有不同的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)效應(yīng)：?jiǎn)为?dú)使用NAA濃度為2.0mg/L時(shí)誘導(dǎo)率最高，生長(zhǎng)勢(shì)亦較好，而單獨(dú)使用2,4-D或6-BA效果都不理想，單獨(dú)使用KT時(shí)，各濃度下均無愈傷組織產(chǎn)生。在使用組合激素NAA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+6-BA2.0mg/L時(shí)誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)勢(shì)均最佳，此時(shí)的愈傷組織是用作細(xì)胞培養(yǎng)的最佳材料。,孫敏等（2002） 用多因子正交實(shí)驗(yàn)篩選出MS+2,4-D0.8mg/L+NAA1 mg/L+Z

5、T0.2mg/L固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織出愈率快、誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛、顏色為淺黃色或白色、形狀疏松呈細(xì)顆粒狀，是篩選出的最佳愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。,張向飛等（2004） 在長(zhǎng)春花的繼代培養(yǎng)的懸浮液中加入不同濃度的外源ABA、乙烯利和ASA，培養(yǎng)24h測(cè)得吲哚總堿及其中阿瑪堿和長(zhǎng)春質(zhì)堿含量均有明顯提高。,趙劍等（1999） 在誘導(dǎo)長(zhǎng)春花愈傷組織的過程中使用不同種類和水平的激素對(duì)生物堿的合成影響較大，發(fā)現(xiàn)2,4-D顯著抑制生物堿合成。,金屹等（1997） 實(shí)驗(yàn)表明在生長(zhǎng)階段采用加2,4-D的培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)最快，在產(chǎn)堿時(shí)采用加入NAA的培養(yǎng)基，以利于次級(jí)代謝物的生產(chǎn)。,鄭宗坤等（2001） 實(shí)

6、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用2,4-D：KT=235ppm：1ppm的激素配方，不僅誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)時(shí)間短，而且誘導(dǎo)出來的組織細(xì)胞群生長(zhǎng)良好、快速，組織結(jié)構(gòu)呈乳白色，疏松呈顆粒狀，適合后面的繼代培養(yǎng)和大量繁殖，用于誘導(dǎo)長(zhǎng)春花葉柄的愈傷組織細(xì)胞較為理想,光照時(shí)間和光質(zhì)都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和生物堿類的積累。 鄭宗坤的實(shí)驗(yàn)中 暗培養(yǎng)10d后，采用12h/d光照條件培養(yǎng)，效果理想。 光照對(duì)愈傷組織培養(yǎng)的影響：（參考相關(guān)文獻(xiàn)所得） (1)在后指數(shù)期光強(qiáng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有些影響，而對(duì)生物堿含量無明 顯影響（陳敏等. 2001）； (2)以白光為基準(zhǔn)，藍(lán)光對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生物堿積累均有促進(jìn)作用，紅光、黃光影響程度在白光之下，綠光有抑制作用

7、（元 英進(jìn)等.光強(qiáng)和單色光對(duì)長(zhǎng)春花愈傷組織培養(yǎng)的影響,1993); (3)一般認(rèn)為光對(duì)阿瑪堿/蛇根堿比值具有調(diào)節(jié)作用。鄭珍貴等 （1999）認(rèn)為光照顯著減少了阿瑪堿生成量，但光照時(shí)間對(duì)阿 瑪堿含量和釋放量影響不大，每天光照12h比24h生成的蛇根 堿多（鄭珍貴等，1996），而阿瑪堿正相反。,光照條件,隨著組培技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,植物組織培養(yǎng)技術(shù)與化學(xué)誘變劑誘變相結(jié)合的離體誘變?cè)絹碓斤@的相得益彰。近年來也受到國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的高度重視。 相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雖然植物組織培養(yǎng)也會(huì)產(chǎn)生無性變異,但離體誘變能使一些有益的性狀突變頻率提高。為今后藥用植物增產(chǎn)的研究開辟了一條可嘗試的新途徑。,誘導(dǎo)及誘變作

8、用,張秀省等（2004）,通過化學(xué)誘變的手段篩選生長(zhǎng)快且吲哚堿含量高的長(zhǎng)春花突變細(xì)胞系。 方法：用不同濃度的甲基磺酸乙酯(EMS)處理長(zhǎng)春花愈傷組織,挑選成活愈傷組織塊繼代擴(kuò)大培養(yǎng),比較其與對(duì)照愈傷組織生長(zhǎng)速率、吲哚總堿積累等方面的差異。 結(jié)果： 用EMS處理的長(zhǎng)春花愈傷組織與對(duì)照相比,不僅生長(zhǎng)快,并且吲哚總堿含量高。 結(jié)論： EMS處理的愈傷組織發(fā)生了變異,變異種是所期望的比較理想的細(xì)胞系。,金屹等（1997）,實(shí)驗(yàn)表明誘變也能使長(zhǎng)春質(zhì)堿產(chǎn)量提高，他們以半致死量40s紫外線照射為誘變劑量，以鹽酸色氨酸乙酯鹽(TEH)作為選擇壓，效果較好，且未引起培養(yǎng)物和培養(yǎng)基的褐變反應(yīng)，與真菌誘發(fā)劑對(duì)愈傷組

9、織的作用有所不同，因而也不存在褐變反應(yīng)和生物堿積累的關(guān)系。和原株相比，突變株積累長(zhǎng)春質(zhì)的時(shí)間有所提前，在整個(gè)培養(yǎng)周期中長(zhǎng)春質(zhì)的積累也是逐步增加的。,利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)藥用植物產(chǎn)生毛狀根，并對(duì)毛狀根進(jìn)行離體培養(yǎng)，是藥用資源植物可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。由于毛狀根基本上具有正常根的生長(zhǎng)功能，與細(xì)胞培養(yǎng)相比，具有生長(zhǎng)速度快，激素自養(yǎng)，分化程度高以及遺傳性能相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種新的培養(yǎng)系統(tǒng)。,發(fā)根的影響因素,長(zhǎng)春花叢生芽的生根受多種因子的影響，植物生長(zhǎng)物質(zhì)和蔗糖是影響其叢生芽生根的主要因子。過高或過低的NAA和IBM的濃度均不利于長(zhǎng)春花叢生芽的生根，蔗糖濃度過高或過低對(duì)芽的生根均不利。此外，培養(yǎng)

10、基種類，碳源種類，氮源種類等也會(huì)影響生根效果。,孫敏等（2002）,用發(fā)根農(nóng)桿菌A4和R10002個(gè)菌株分別感染長(zhǎng)春花的愈傷組織、真葉葉片、葉柄及根,誘導(dǎo)出毛狀根，并對(duì)毛狀根的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，篩選到長(zhǎng)春花叢生芽生根的最佳培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2mg/LNAA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖。用這種培養(yǎng)基進(jìn)行長(zhǎng)春花叢生芽生根繁殖幼苗，不受季節(jié)氣候等客觀條件的限制，大大縮短繁殖周期，降低種苗成本。,自20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)春花中所含的多種次生代謝產(chǎn)物的藥效以來，越來越多的人對(duì)它的研究產(chǎn)生興趣。至今已在長(zhǎng)春花細(xì)胞和組織培養(yǎng)物中共發(fā)現(xiàn)多種次生代謝產(chǎn)物，使長(zhǎng)春花成為研究吲哚生物堿合成的模式

11、植物。由于原植物中的有效成分含量較低，人們?cè)诩?xì)胞及組織培養(yǎng)方面對(duì)長(zhǎng)春花進(jìn)行了大量的研究，使之成為植物細(xì)胞工程學(xué)研究的模式系統(tǒng)。,前景展望,目前利用細(xì)胞工程和遺傳工程等生物技術(shù)在改良長(zhǎng)春花品質(zhì)提高生物堿含量等方面已取得了一些成績(jī)，但是細(xì)胞培養(yǎng)單位產(chǎn)出成本高，高密度培養(yǎng)時(shí)生物堿含量降低，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化體中尚未得到可用于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)株系。隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)和設(shè)計(jì)出更合理的反應(yīng)器，以及將控制長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、文多靈合成的關(guān)鍵酶基因克隆出來并轉(zhuǎn)化成功，篩選出優(yōu)良無性系，利用生物技術(shù)獲得高含量抗癌生物堿的優(yōu)良變異克隆，長(zhǎng)春花抗癌生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)將會(huì)取得更大的進(jìn)步。,成果：

12、,3月31日：MS培養(yǎng)基接種長(zhǎng)春花種子 for 無菌苗,總共接種20顆種子，萌發(fā)5顆，一顆發(fā)霉（成苗后）。原因：可能由于消毒時(shí)間（酒精30秒，升汞10分鐘）太長(zhǎng)，所以萌發(fā)率不高。,4月26日 配制誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基 （1）MS+2.0mg/l 2,4-D+1.0mg/lBA （2）MS+1.0mg/l 2,4-D+0.5mg/lBA,4月27日 接種長(zhǎng)春花外植體 for 愈傷組織,成果：,共16瓶培養(yǎng)基,(1)(2)各8瓶， 4瓶（1）和（2）:君子蘭葉片 都沒有長(zhǎng)愈傷，也沒有發(fā)霉，周圍一圈變黃了，可能是因?yàn)橄緦⑷~片細(xì)胞殺死了。 另外4瓶（1）和（2）：長(zhǎng)春花葉片，莖段。 莖段（1），（2）各一瓶，都沒有長(zhǎng)愈傷，可能是因?yàn)樘哿?，消毒時(shí)細(xì)胞被殺死。葉片（1），（2）各三瓶，都長(zhǎng) 出了愈傷，但是在（1）配方下愈傷比較致密，褐色出現(xiàn)比較多（2）配方下相對(duì)較疏松，且比較透明，說明（2）配方（比例相同，濃度低）比（1）配方更適