1、生物素-親和素標(biāo)記技術(shù),第一組,一 背景 二 原理 三 實(shí)驗(yàn)方法及步驟 四 應(yīng)用 五 反應(yīng)特點(diǎn) 六 應(yīng)用前景,一 背景,生物素： 又稱維生素H 、輔酶R，是水溶性維生素，也屬于維生素B族。,1936年，兩位德國科學(xué)家Kogl和Tonnis從煮熟的鴨蛋黃中分離提取出一種結(jié)晶物質(zhì)，是酵母生長所必需的，稱之為“生物素”。生物素廠泛存在于自然界的各種生物中,是人類和動物維持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物中的分布很廣，幾乎每種食物中都含有少量的生物素，加之人體每日的所需量又很少,所以，人們一般都不缺乏這種維生素。,親和素： 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每個分子由4個

2、亞基組成，可以和4個生物素分子親密結(jié)合。 親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大， 兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的 結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。 因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可大大提高ELISA的敏感度。 卵白親合素 親合素 鏈親合素 卵黃親合素 類親合素等 后兩種因其特異性親合力低，研究不多，前兩種目前已深入研究并得到廣泛應(yīng)用。,二 原理,20世紀(jì)60年代初發(fā)現(xiàn)了生物素(biontin，B)和卵白素(avidin，A)，其親和力至少比抗原-抗體結(jié)合力高百萬倍，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中具有最強(qiáng)親

3、和力的物質(zhì)。 每個 分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結(jié)合。 親和素與生物素都可與蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)、熒光素等分子結(jié)合而不影響后者的生物活性，是理想的標(biāo)記劑。一個抗體分子可偶聯(lián)數(shù)十個生物素或親和素分子，而親和素或生物素分子又可與酶或熒光素結(jié)合，從而組成一個生物放大系統(tǒng)，顯著提高檢測的靈敏度。常用的有親和素-生物素標(biāo)記法(Labeled avidinbiotin，LAB)、親和素-生物素橋法(bridged avidinbiotin, BAB)和親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(avidinbiotinperoxid ase complex，ABC)。 生物素-親合素系統(tǒng)

4、 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。BAS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的各個領(lǐng)域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。,三 實(shí)驗(yàn)方法及步驟,生物素-親和素標(biāo)記技術(shù)的主要方法 ： （1）橋-親和素-生物素標(biāo)記法（BAB法） （2）親和素-生物素-過氧化物酶法（ABC法） （3）標(biāo)

5、記生物素-抗生物素法 （ LAB法）,（1）橋-親和素-生物素標(biāo)記法（BAB法）,橋-親和素-生物素標(biāo)記法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分為直接法和間接法，直接法是以游離的親和素(或鏈霉親和素)作為橋聯(lián)劑，利用親和素的多價性，將生物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素(如酶標(biāo)生物素)聯(lián)結(jié)起來，達(dá)到檢測反應(yīng)分子的目的。間接法則是在抗原與特異性抗體結(jié)合反應(yīng)后，再用生物素化的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，從而使靈敏度進(jìn)一步提高。由于生物素化抗體分子上連有多個生物素，因此，最終形成的抗原-生物素化抗體-親和素-酶標(biāo)生物素復(fù)合物可積聚大量的酶分子。加入相應(yīng)酶作用底物后，

6、會產(chǎn)生強(qiáng)烈的酶促反應(yīng)，提高檢測靈敏度。Smith K A5利用間接BAB法檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，其靈敏度比常規(guī)ELISA高1 000多倍。,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）步驟（間接法）,1 包被抗原 2 洗滌 3 待測血清（抗體） 4 洗滌 5 酶標(biāo)二抗 6 洗滌 7 顯示物A、B 8 加終止液 (H2SO4),酶標(biāo)板,橋-親和素-生物素標(biāo)記（BAB法）步驟,間接法步驟： 1包被抗原 2洗滌 3待測抗體 4洗滌 5生物素標(biāo)二抗 6洗滌 7加親和素 8洗滌 9加酶標(biāo)生物素 10洗滌 11加底物 12顯色后加終止液,直接法步驟,（2）親和素-生物素-過氧化物酶法 （ABC法）,即親和

7、素-生物素-過氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是預(yù)先按一定比例將親和素(或鏈霉親和素)與酶標(biāo)生物素結(jié)合，形成可溶性的親和素(或鏈霉親和素)-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，當(dāng)其與檢測反應(yīng)體系中的生物素化一抗（直接法）或生物素化二抗（間接法）相遇時，復(fù)合物中未飽和的親和素(或鏈霉親和素)結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合。在親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物形成時，一個標(biāo)記了生物素的酶分子可通過其生物素連接多個親和素(或鏈霉親和素)分子，一個親和素(或鏈霉親和素)分子又可橋聯(lián)多個酶標(biāo)生物素分子，這樣就形成具多級放大作用的晶格樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中網(wǎng)絡(luò)

8、了大量酶分子。ABC法背景染色淡，方法簡單，節(jié)約時間，可用于雙重或多重免疫染色，尤其在組織切片和細(xì)胞懸液中抗原的檢測和亞細(xì)胞水平定位分析中應(yīng)用較廣。,+,+ABC,B-E + A ABC,Ab-Ag-Ab-B + ABC Ab-Ag-Ab-B-ABC,直接法：,直接法 間接法,（3）標(biāo)記生物素-抗生物素法,標(biāo)記親和素-生物素法(labeled avidin-biotin，LAB)直接法是以標(biāo)記親和素(或鏈霉親和素)直接與免疫復(fù)合物中的生物素化一抗連接進(jìn)行酶呈色反應(yīng)，間接法是采用生物素化的二抗和抗原結(jié)合，由于加入了二抗，較直接法檢測靈敏度要高，對免疫細(xì)胞中免疫球蛋白的定位具有特異性。LAB法需以

9、生物素標(biāo)記一抗，應(yīng)用不如ABC法普遍，與ABC法相比，LAB法操作較簡單，但靈敏度較低,四 應(yīng)用,1 在免疫學(xué)中的應(yīng)用 免疫熒光技術(shù)中的應(yīng)用 免疫放射技術(shù)中的應(yīng)用 膠體金技術(shù)中的應(yīng)用 免疫酶技術(shù)中的應(yīng)用 ELISA中的應(yīng)用 2在分子生物學(xué)中的應(yīng)用 3在組織化學(xué)中的應(yīng)用 4 在分離純化中的應(yīng)用（親和層析）,4.1在免疫學(xué)中的應(yīng)用,4.1.1在免疫熒光技術(shù)中的應(yīng)用 BAS應(yīng)用于免疫熒光分析(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)技術(shù)， 可用熒光素直接標(biāo)記親和素(或鏈霉親和素)或采用游離親和素(或鏈霉親和素)搭橋， 兩端分別連接生物素和熒光素。與常規(guī)熒光抗體法或單獨(dú)的BAS標(biāo)記法

10、相比， BAS標(biāo)記法結(jié)合熒光抗體技術(shù)可明顯地提高檢測的靈敏度和特異性。 張錦明等用99Tcm替代111In標(biāo)記BAS在腫瘤放免顯像預(yù)定位DTPA-生物素溶液， 結(jié)果測得99Tcm-DTPA-生物素的標(biāo)記率大于90%。 4.1.2 在免疫放射技術(shù)中的應(yīng)用 BAS與免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶聯(lián)， 先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與 抗原(標(biāo)準(zhǔn)抗原和待測抗體)同時反應(yīng)，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物， 再用放射性同位素標(biāo)記的親和素(或鏈霉親和素)與復(fù)合物中的生物素結(jié)合， 最終使反應(yīng)信號放大。 李貴平等用153Sm標(biāo)記BA

11、S，再標(biāo)記抗CEA 單抗， 最后在結(jié)腸癌裸鼠模型中進(jìn)行顯像和體內(nèi)分布測定， 結(jié)果腫瘤顯像時間大大縮短。郝君等采用生物素-磁珠富集微衛(wèi)星， 與傳統(tǒng)放射性同位素雜交法相結(jié)合，構(gòu)建篩選大黃魚的微衛(wèi)星文庫。,4.1.3在膠體金技術(shù)中的應(yīng)用 BAS應(yīng)用于膠體金技術(shù)，其原理為帶正電荷的鏈霉親和素標(biāo)記的帶負(fù)電荷的膠體金顆粒能與生物素緊密結(jié)合，使檢測信號在只有膠體金標(biāo)記或只有BAS標(biāo)記的基礎(chǔ)上得到擴(kuò)大。呂豐等應(yīng)用石英晶體微天平(QCM)研究了基于BAS的葡萄糖氧化酶的固定化，結(jié)果在利用BAS固定過的葡萄糖氧化酶過程中，經(jīng)過納米金顆粒修飾的QCM基片對酶的吸附量比未經(jīng)修飾的基片多。張志鋒等以組裝型金磁微粒和氨基

12、末端磁性微粒為載體分別通過物理吸附和共價作用制備兩種鏈親和素-磁性微粒，其具有較高的游離生物素結(jié)合容量以及較高的生物素標(biāo)記寡核苷酸的結(jié)合能力。,4.1.4 在免疫酶技術(shù)中的應(yīng)用 BAS應(yīng)用于免疫酶技術(shù)，通過生物素-親和素將免疫復(fù)合物與辣根過氧化物酶連接起來，形成免疫酶-生物素-親和素法。趙金富等用合成的雌三醇-生物素復(fù)合物(E3-Biotin)結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素(HRP-Avidin)作為免疫分析探針測定血清中的雌三醇。結(jié)果表明，具有很高的靈敏度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和抗非特異性吸附干擾的能力。魏孔吉等建立了可用于快速、靈敏地檢測雙酚A的生物素-親和素放大酶聯(lián)免疫吸附測定法，樣品處理簡單

13、，結(jié)果滿意。宋曉榮等用酯化生物素標(biāo)記N15C，辣根過氧化物酶標(biāo)記N16D，檢測cTnT，檢測靈敏度為1.0 g/L，特異性高。,4.1.5在ELISA中的應(yīng)用 用生物素化的抗體替代常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體，然后連接親和素-酶結(jié)合物(BA-ELISA)、或親和素及酶標(biāo)生物素(BAB-ELISA)或ABC試劑(ABC-ELISA)，從而使反應(yīng)信號放大，提高檢測的靈敏度。王傳彬等用生物素標(biāo)記的純化抗禽流感病毒H5亞型血凝素單抗和酶標(biāo)親和素檢測H1、H15亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)毒株和H5、H7、H9亞型AIV分離株，與血凝和血凝抑制試驗(yàn)比較，純化后的單抗具有良好的反應(yīng)活性。祝軍等將BA-辣根過氧化物酶復(fù)合物

14、系統(tǒng)ELISA策略，對ANEP寡核苷酸適配子的親合力進(jìn)行測定。,4.2 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,BAS在分子生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用日漸增多，目前主要集中在以生物素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行的定位檢測以及將免疫測定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測等方面。自從合成了生物素化的脫氧三磷酸脲苷(dUTP)和UTP等核苷酸單抗以來，以生物素化多核苷酸為探針的核酸雜交技術(shù)有了很大發(fā)展，常用于Southern、Northern和原位雜交等。試驗(yàn)時，標(biāo)記探針先與細(xì)胞或染色體原位(或是固定在乙酸纖維素膜上)的變形核酸分子進(jìn)行雜交，然后用偶聯(lián)了酶或熒光物質(zhì)的親和素(或鏈霉親和素)識別雜交互補(bǔ)

15、片段，使其顯色或產(chǎn)生熒光，這種技術(shù)克服了放射性核酸探針標(biāo)記與檢測的缺點(diǎn)，應(yīng)用潛力很大。,4.2 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,不對稱PCR 目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針;基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究,4.2 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,高濃度引物,低濃度引物,不對稱PCR,Southern 印跡雜交,4.2 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,分子分子雜交的基本類型,固相雜交 液相雜交 原位雜交 基因芯片,4.2 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,分子雜交的基

16、本類型,液相雜交 將參加液相雜交的兩條核酸鏈都游離在溶液中，在一定條件下（溶液的離子強(qiáng)度、溫度、時間等）進(jìn)行雜交，然后再將未雜交的探針除去，即得到雜交后的核酸分子。,4.2 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,液相雜交,4.2 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,4.3 在組織化學(xué)中的應(yīng)用,將混有親和素和生物素的染料濃聚于靶細(xì)胞表面，能使細(xì)胞與染料更好的結(jié)合，最大優(yōu)點(diǎn)為精確度被提高，結(jié)果簡單易測，更利于靶細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察。張志強(qiáng)等應(yīng)用ABC法對赤鏈蛇消化道5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)細(xì)胞的分布密度和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示5-HT在其整個消化道中均有分布。徐衛(wèi)等用SAP法對兒童急性淋巴

17、細(xì)胞白血病(ALL)和成人患者的ALL骨髓和外周血進(jìn)行Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ki-67抗原在兒童ALL中的表達(dá)略低于成人。,4 .4 在分離純化中的應(yīng)用（親和層析）,1.平衡 2.上樣 3.洗雜 4.洗脫,五 反應(yīng)特點(diǎn),1. BAS具有高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性和適用性等特點(diǎn)。 2.生物素易與蛋白質(zhì)和核酸類等生物大分子結(jié)合，再和生物素衍生物結(jié)合，將信號多級放大，能保持大分子物質(zhì)的原有生物活性。 3.親和素與生物素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性，不增加非特異性干擾，也不會因反應(yīng)試劑濃度高低受影響。 4.酸、堿、變性劑及有機(jī)溶劑均不會影響親和素與生物素的結(jié)合力。裴仁軍等試驗(yàn)結(jié)果表明，鏈霉親和素與生物素能夠在結(jié)合表面形成均一的多層膜維系緊密的結(jié)合。 5.BAS不僅能與酶、熒光素和放射性核素等各類標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，還可制成親和介質(zhì)，用于分離提純。 6.BAS操作方便，反應(yīng)結(jié)果可用肉眼觀察，實(shí)驗(yàn)成本低。,六 應(yīng)用前景,BAS具有諸多優(yōu)點(diǎn)，主要應(yīng)用于抗原、抗體、細(xì)胞等的定位和檢測，能將形態(tài)、 定位研究與功能、代謝研究有機(jī)地結(jié)合在一起，此方法經(jīng)不斷改進(jìn)日趨成熟，其相 關(guān)試劑盒也逐步商品化，在各個學(xué)科的應(yīng)用已占有相當(dāng)高的比例，科研工作中的各 種標(biāo)記技術(shù)都是為了使信號不斷地放大，BAS與其他標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用更能成倍的 擴(kuò)