1、熒光分光光度法一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)熒光分光光度法的基本原理；2、學(xué)習(xí)熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)和操作方法；3、學(xué)習(xí)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜曲線的繪制方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理熒光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS）通常又叫熒光分析法，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、所需樣品量少等特點(diǎn)，已成為一種重要的痕量分析技術(shù)。熒光（fluorescence）是分子吸收了較短波長(zhǎng)的光（通常是紫外光和可見(jiàn)光），在很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)射出比照射光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。由此可見(jiàn)，熒光是一種光致發(fā)光。任何熒光物質(zhì)都有兩個(gè)特征光譜，即激發(fā)光譜（excitation spectrum）和發(fā)射光譜（emission spect

2、rum）或稱熒光光譜（fluorescence spectrum）。激發(fā)光譜表示不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率。繪制激發(fā)光譜時(shí)，將發(fā)射單色器固定在某一波長(zhǎng)，通過(guò)激發(fā)單色器掃描，以不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，記錄熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，即為激發(fā)光譜，其形狀與吸收光譜極為相似。熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)的相對(duì)強(qiáng)度。繪制熒光光譜時(shí)，使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變，通過(guò)發(fā)射單色器掃描以檢測(cè)各種波長(zhǎng)下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，記錄熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，即為熒光光譜。激發(fā)光譜和熒光光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)，而且是選擇測(cè)定波長(zhǎng)的依據(jù)。熒光強(qiáng)度（F）是表征熒光發(fā)射的相對(duì)強(qiáng)弱的

3、物理量。對(duì)于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定波長(zhǎng)和一定強(qiáng)度的入射光照射下，當(dāng)液層的厚度不變時(shí)，所發(fā)生的熒光強(qiáng)度和該溶液的濃度成正比，即該式即熒光分光光度法定量分析的依據(jù)。使用時(shí)要注意該關(guān)系式只適用于稀溶液。三、 儀器與試劑F-4500熒光光譜儀；比色管（10mL）；牛血清白蛋白（BSA）四、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、 開(kāi)機(jī)準(zhǔn)備：接通電源，啟動(dòng)電腦。打開(kāi)光譜儀主機(jī)電源，預(yù)熱15分鐘。2、 運(yùn)行FL solution軟件，設(shè)定檢測(cè)方法和測(cè)量參數(shù)：EX（激發(fā)波長(zhǎng)）：280nmEM（發(fā)射波長(zhǎng)）：340nmEX掃描范圍：210nm330nmEM掃描范圍：290nm450nmEX縫寬：2.5nm，EM縫寬：2.5nm掃描

4、速度：240nm/minPMT電壓：700V3、 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的繪制：先固定激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，在290450nm測(cè)定熒光強(qiáng)度，獲得溶液的發(fā)射光譜，在343nm附近為最大發(fā)射波長(zhǎng)em；再固定發(fā)射波長(zhǎng)為em，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為200nmem時(shí)的熒光強(qiáng)度，獲得溶液的激發(fā)光譜，在280nm附近為最大激發(fā)波長(zhǎng)ex。4、 退出FL solution軟件，關(guān)閉光譜儀主機(jī)電源，關(guān)閉計(jì)算機(jī)。五、 數(shù)據(jù)處理以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，分別繪制激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。發(fā)射光譜圖激發(fā)光譜圖由圖可知，發(fā)射波長(zhǎng)為342nm，激發(fā)波長(zhǎng)為283nm。六、 思考題1、 畫出熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)圖。2、 熒光光譜儀與紫外光譜儀在結(jié)構(gòu)上有何不同？為什么要這樣設(shè)計(jì)？答：紫外光譜儀的檢測(cè)器與單色器在一條直線上，測(cè)的是透射光；而熒光光譜儀的檢測(cè)器與單色器成90度角，測(cè)的是物質(zhì)發(fā)射光，這樣可以減少或者消除背景干擾，提高靈敏度。3、 如何繪制激發(fā)光譜和發(fā)射光譜曲線？答：先固定激發(fā)波長(zhǎng)為一波長(zhǎng)1（一般為340nm），在1700nm測(cè)定熒光強(qiáng)度，獲得溶液的發(fā)射光譜，在圖上找出最大發(fā)射波長(zhǎng)em；再固定發(fā)射波長(zhǎng)em，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為200nmem時(shí)的熒光強(qiáng)度，獲得溶液激發(fā)光譜