1、 摘要：恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來的一門新型的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。目前主要的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有：滾環(huán)核酸擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、鏈替代擴(kuò)增、依賴核酸序列擴(kuò)增和解鏈酶擴(kuò)增。它們都具有共同的特點(diǎn)：恒溫、高效、特異、不需要特殊的儀器設(shè)備。本文就現(xiàn)階段恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)及其在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用情況和前景做一綜述。關(guān)鍵詞：恒溫?cái)U(kuò)增；PCR引言：近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基于核酸檢測(cè)的診斷方法已大量建立并廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)就是在此背景下出現(xiàn)的。與其它的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，恒溫?cái)U(kuò)增有快速、高效、特異的優(yōu)點(diǎn)且無需專用設(shè)備。所以它一經(jīng)出現(xiàn)就被許多學(xué)者認(rèn)為是一種有可能與P

2、CR 媲美的檢測(cè)方法，目前主要的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有：滾環(huán)核酸擴(kuò)增（rolling circle amolification，RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、鏈替代擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）、依賴核酸序列擴(kuò)增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA） 和解鏈酶擴(kuò)增（helix dependent amplification，HAD），這些技術(shù)各有特點(diǎn)，這也決定了它們?cè)趧?dòng)物疾病檢測(cè)中的應(yīng)用情況，下面就它們的原理

3、、特點(diǎn)及其在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。1 滾環(huán)核酸擴(kuò)增1. 1 滾環(huán)核酸擴(kuò)增的原理滾環(huán)核酸擴(kuò)增（rolling circleamolification, RCA）是通過借鑒病原生物體滾環(huán)復(fù)制DNA 的方式而提出的1，可分為線性擴(kuò)增與指數(shù)擴(kuò)增兩種形式。線性RCA 是引物結(jié)合到環(huán)狀DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，產(chǎn)物是具有大量重復(fù)序列（與環(huán)狀DNA 完全互補(bǔ)）的線狀單鏈。線性RCA 用于靶核酸擴(kuò)增僅限于一些具有環(huán)狀核酸的病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體，線性擴(kuò)增倍數(shù)為105。指數(shù)RCA原理與線性RCA 相同，采用與環(huán)狀DNA 序列完全一致的第二種引物，該引物與第一次線性RCA 產(chǎn)物結(jié)合并

4、酶促延伸，其產(chǎn)物又作為第一種探針的模板，這樣一來在很短的時(shí)間內(nèi)（1h），產(chǎn)物呈指數(shù)遞增。指數(shù)RCA 可用于非環(huán)狀DNA 的擴(kuò)增，增倍數(shù)能達(dá)107 2。1. 2 滾環(huán)核酸擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足RCA 的優(yōu)勢(shì)：(1) 高靈敏度。RCA有很強(qiáng)的擴(kuò)增能力，線性RCA 的效率可達(dá)到l05 倍，而指數(shù)RCA 的效率可達(dá)到109 倍，這一高靈敏度特性使其能夠檢測(cè)到單拷貝水平3；(2)高序列特異性。可以區(qū)分單一位點(diǎn)的不同模式；(3) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過磷酸化處理后可以直接用來測(cè)序。(4)高通量。RCA 可以在靶目標(biāo)上形成閉合的環(huán)狀序列，確保RCA 產(chǎn)生的信號(hào)集中在一點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)原位擴(kuò)增和載片擴(kuò)增； RCA 只要保證探針的

5、識(shí)別段序列與靶序列互補(bǔ)，不需要考慮靶序列的性質(zhì)，因此檢測(cè)RNA 時(shí)不再需要預(yù)先進(jìn)行RNA 的逆轉(zhuǎn)錄。RCA 的不足：（1）鎖式探針常接近100bp， 合成費(fèi)用較高。2000 年，Antson DO 等采用PCR 方法在實(shí)驗(yàn)室合成探針，可以在很大程度上降低成本；（2）信號(hào)檢測(cè)時(shí)的背景問題。在RCA 反應(yīng)過程中未成環(huán)的鎖式探針和未結(jié)合探針的模板DNA 或者RNA 可能產(chǎn)生一些背景信號(hào)。1. 3 滾環(huán)核酸擴(kuò)增在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用雖然可以通過一些方法部分克服RCA 的不足，但也進(jìn)一步增加了反應(yīng)成本，使得RCA 在動(dòng)物疾病的臨床檢測(cè)中不適合被采用。2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增2. 1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的原理環(huán)介導(dǎo)等溫

6、擴(kuò)增其擴(kuò)增原理是基于DNA 在65左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA 的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈，在此前提下利用4 種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6 個(gè)特定區(qū)域，在鏈置換型DNA 聚合酶的作用下，以外側(cè)引物區(qū)段的3末端為起點(diǎn)，與模板DNA 互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)鏈置換DNA合成4。2. 2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足LAMP 的優(yōu)勢(shì)：（1）擴(kuò)增效率高，能夠在1h 內(nèi)有效的擴(kuò)增1-10 個(gè)拷貝的目的基因，擴(kuò)增效率為普通PCR的10 倍-100 倍；（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。LAMP 的不足：（1） 對(duì)引物的要求特別高；（2） 擴(kuò)增產(chǎn)物不能

7、用于克隆測(cè)序，只能用于判斷；（3）由于其敏感性強(qiáng)，特別容易形成氣溶膠，造成假陽性影響檢測(cè)結(jié)果。2. 3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物疾病檢測(cè)中的應(yīng)用LAMP 技術(shù)從誕生之日起就被認(rèn)為是最有可能代替PCR 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的方法。2008 年Anne-Lie B 等應(yīng)用RT-LAMP建立了豬水皰病病毒(SVDV)的診斷方法5，該方法對(duì)血清樣本的敏感性相當(dāng)于實(shí)時(shí)PCR，對(duì)糞便樣品的敏感性優(yōu)于實(shí)時(shí)PCR。3 鏈置換擴(kuò)增3. 1 鏈置換擴(kuò)增的原理鏈置換擴(kuò)增其原理是基于在靶DNA 兩端帶有被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將鏈DNA 打開缺口，DNA 聚合酶延伸缺口3端并替換下一條D

8、NA 鏈6。被替換下來的DNA 單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復(fù)進(jìn)行，使靶序列被高效擴(kuò)增。SDA 的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶、兩對(duì)引物、dNTP 以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。3. 2 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與不足SDA 的優(yōu)點(diǎn)：（1） 擴(kuò)增效率高，據(jù)Walker 等人的報(bào)道，采用SDA 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌總DNA 中的一段序列時(shí)，37反應(yīng)2 小時(shí)后，可將靶序列擴(kuò)增106 倍7；（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。SDA 的不足：（1）SDA 產(chǎn)物不均一。在SDA 循環(huán)中總要產(chǎn)生一些單、雙鏈產(chǎn)物，用電泳法檢測(cè)時(shí)必然要出現(xiàn)拖

9、尾現(xiàn)象。（2）SDA 產(chǎn)物不可能直接用于克隆，測(cè)序和表達(dá)。使得SDA 在基因工程方面沒有優(yōu)勢(shì)；（3）SDA 產(chǎn)物的檢測(cè)手段有待提高。目前SDA 產(chǎn)物檢測(cè)的主導(dǎo)方法是熒光偏振檢測(cè)，但該檢測(cè)方法需要特殊的檢測(cè)儀器- 熒光分光光度計(jì)，這限制了SDA 在臨床的廣泛應(yīng)用。3. 2 鏈置換擴(kuò)增在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用當(dāng)前SDA 方法主要應(yīng)用于分枝桿菌核酸定性檢測(cè)、病毒體外進(jìn)化研究23和芯片雜交等方面，還沒有運(yùn)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)。4 依賴核酸序列擴(kuò)增4. 1 依賴核酸序列擴(kuò)增的原理依賴核酸序列擴(kuò)增(NASBA)是在PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)。是由1 對(duì)帶有T7 啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫、基于酶

10、反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)在41進(jìn)行，可在2 h 內(nèi)將模板RNA 擴(kuò)增109 倍8，比常規(guī)PCR 法高1000 倍。4. 2 依賴核酸序列擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足NASBA 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)RNA 病毒的檢測(cè)，因?yàn)椋海?）它的引物上帶有T7 啟動(dòng)子序列，而外來雙鏈DNA 無T7 啟動(dòng)子序列，不可能被擴(kuò)增，因此在有DNA 污染的條件下，NASBA 技術(shù)同樣具有較高的特異性和靈敏度9；（2）NASBA 將反轉(zhuǎn)錄過程直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，縮短了反應(yīng)時(shí)間。NASBA 也存在許多缺陷：（1）反應(yīng)成分比較復(fù)雜；（2） 需要3 種酶使得反應(yīng)成本較高；（3）對(duì)DNA 病毒的檢測(cè)上NASBA 就顯得不是那么適合。4. 3

11、 依賴核酸序列擴(kuò)增在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用NASBA 與LAMP 一樣在恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中是相對(duì)成熟技術(shù)，現(xiàn)在已應(yīng)用于動(dòng)物疫病檢測(cè)中。我國(guó)2004 年發(fā)布的8 項(xiàng)禽流感系列標(biāo)準(zhǔn)中，有兩項(xiàng)應(yīng)用了NASBA檢測(cè)方法， 即GBT19439-2004H5 亞型禽流感病毒NASBA 檢測(cè)方法和GBTl9440-2004禽流感病毒NASBA 檢測(cè)方法10。6 小結(jié)動(dòng)物疫病的檢測(cè)是一項(xiàng)特殊的檢測(cè)工作，它一方面需要快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，另一方面對(duì)檢測(cè)的成本也有著苛刻的要求。而恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在很大程度上符合了它的需要，雖然說當(dāng)前把恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)運(yùn)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)還有著不少的缺陷，但它的優(yōu)越性也是有目共睹的，特別是其中的

12、LAMP 和NASBA 已經(jīng)逐漸開始運(yùn)用到動(dòng)物疫病的檢測(cè)中。我們相信通過對(duì)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的不斷完善，它必然會(huì)和PCR 技術(shù)一樣成為動(dòng)物疫病檢測(cè)中不可缺少的檢測(cè)手段。【參考文獻(xiàn)】 1 Hobbie J E，Daley R J, and JasperS. Use of nuclepore filters for countingbacteria by fluorescence microscopyJ.Appl Envir Microbiol，1977，33 (5)：1225-12282 李影，王偉利，錢愛東. 畜產(chǎn)中相關(guān)食源性致病菌“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”的檢測(cè)策略J.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26(1)

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