第十章 分子雜交技術,分子雜交（molecular hybridization）是用一個DNA單鏈或RNA單鏈與另一被測DNA單鏈形成雙鏈，以測定某特異順序是否存在。,Basic Principle,Denature,Hybridize,Southern, Fish,PCR,Protein: Antigen-antibody interaction,DNA: denaturation and hybridization of the helix structure,第十章 分子雜交技術,第一節(jié) 分子雜交 第二節(jié) 核酸雜交簡史與原理 第三節(jié) 核酸探針標記的方法 第四節(jié) 核酸分子雜交因素 第五節(jié) 幾種常見的雜交 第六節(jié) 其他類型雜交介紹 第七節(jié) 原位雜交,第一節(jié) 分子雜交,1.1 原位分子雜交（in situ hybridization） 1.2 斑點雜交（dot blotting） 1.4 Northern hybridization 1.5 Western blotting 1.6 電鏡觀察,1.1 原位分子雜交（in situ hybridization） 原位分子雜交有兩種: 玻片原位雜交 膜上原位雜交,玻片原位雜交 一般都先要制片，如中期染色體片和組織切片等; 片子制好后不染色，放在緩沖溶液中緩緩變性，然后再加入探針讓其復性，將沒有結(jié)合的探針充分洗脫； 若是同位素標記探針，就須在片子涂一層乳膠或復蓋上一張同樣大小X光片進行放射自顯影，然后觀察同位素的爆光點在組織細胞或染色體上的相對位置。 如用熒光標記可用熒光顯微鏡直接觀察。,膜上分子雜交 將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜上（以前用硝酸纖維膜），這種膜只吸附單鏈DNA。 將影印好的膜用NaOH處理，這樣不僅可以殺死細菌，同時可使DNA變性吸附在膜上； 然后用無關的單鏈DNA，如常用小牛胸腺DNA和鮭魚精子DNA吸附到膜上的空白處，稱預雜交，防止探針被吸附在背景上，干撓實驗結(jié)果。 膜經(jīng)中和后再將同位素探針和膜放在緩沖溶液中緩緩復性，經(jīng)放射自顯影來確定陽性菌落。,1.2 斑點雜交（dot blotting） 也叫狹縫雜交。是由Southern blot衍生而來。方法是將某種生物的總DNA直接點滴在尼龍膜上，或者通過一個小的長形狹縫印在尼龍膜上，將后將膜變性處理，預雜交后，經(jīng)中和、洗脫、干燥。 再將其和探針放入復性緩沖溶液中緩緩復性，洗滌干燥后進行放射自顯影，觀察結(jié)果。這種方法是用來初步探測某種生物中含有一種特殊的基因或順序。來分析DNA樣品之間的同源性。 此法因有假陽性的存在，所以發(fā)現(xiàn)陽性斑后還要進一步做Southern blotting加以驗證。,1.3 Southern blotting 該技術是Southern，E.M于1975年首先建立的，故稱為Southern雜交，該方法經(jīng)Southern印跡法將膠上的電泳條帶吸印尼龍膜上，然后和DNA探針雜交。 用這種方法可以制作染色體的物理圖譜，限制性片段長度的多態(tài)性，及動物園吸?。╖oo blot）（用一個物種的DNA探針和別種動物的DNA進行Southern blotting）等。,1.4 Northern hybridization Northern雜交的技術和Southern雜交相似，作者并不姓“Northern”，因“Southern”意為“南方”，故戲稱自己的分析方法為“北方”“（Northern）雜交。 Northern 雜交與Southern雜交主要的不同之處在于檢驗RNA，而不是DNA。 首先是提取某種生物或組織的總RNA或mRNA，然后用含有變性劑的瓊脂糖凝膠電泳分離RNA，變性劑的作用是防止RNA自我退火形成局部雙鏈，影響泳動率，干擾實驗結(jié)果。 電泳分離后再將凝膠上的RNA帶吸印到尼龍膜上，在液相中和標記的核酸探針進行雜交。用此方法可以測定某基因表達的時空特異性。,1.5 Western blotting 既然有了“南方”雜交，“北方”雜交，那么隨之而來的就是“西方”雜交（Western blotting），但Western blotting和前面的幾種雜交都不相同，它是用來測蛋白而不是檢測核酸。 此法是由電場的作用將聚丙烯酰胺的電泳膠上的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以親和反應或免疫反應或結(jié)合反應測定蛋白質(zhì)技術。,1.6 電鏡觀察 先進行分子雜交，再通過電鏡觀察可以進行基因定位，內(nèi)含子的探測以及缺失的確定等。 斷裂基因就是用這種方法發(fā)現(xiàn)的。 電鏡觀察有二種，一是異源雙鏈定位法（Heferoduplex mapping），二是R-環(huán)定位法（R-loop mapping） 將異源DNA雙鏈變性后進行分子雜交，然后制片在電鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)環(huán)形不配對的部分，表明可能存在缺失。 R-環(huán)法是將標記的mRNA和變性后的待測雙鏈DNA進行雜交，制片后，可以觀察到R-環(huán)，這是由于RNA形成的雙鏈比原來的DNA雙鏈更為穩(wěn)定，將一條DNA單鏈置換了出來，表明該mRNA基因就位于R-環(huán)這個位置。,第二節(jié) 核酸雜交簡史與原理,2.1 核酸雜交技術簡史 2.2 核酸雜交原理,2.1 核酸雜交技術簡史 1961年，Hall等開始進行探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體。開拓了核酸雜交技術的研究。 1962年，Bolton等設計了第一種簡單的固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術。 變性DNA固定在瓊脂中，DNA不能復性，但能與其它互補核酸序列雜交。 用放射性標記的短DAN或RNA分子與膠中DNA雜交過夜，然后將膠置于柱中進行漂洗，去除游離探針。 在高溫、低鹽條件下將結(jié)合的探針洗脫，洗脫液的放射性與結(jié)合的探針量呈正比。, 上世紀60年代中期，Nygaard 等的研究為應用標記DNA或RNA探針檢測固定在硝酸纖維素（NC）膜上的DNA序列奠定了基礎。 如Brown等應用這一技術評估了爪蟾rRNA基因的拷貝數(shù)。RNA在代謝過程中被3H尿嘧啶標記，并在過量的情況下與膜上固定的基因組DNA雜交，繼而用RNase處理，消化非特異性結(jié)合的RNA。漂洗后計數(shù)以測定雜交探針的量。 通過計算與已知量DNA雜交的RNA量即可評估rRNA基因數(shù)。由于當時缺乏特異探針，這種方法不能用于研究其它特異基因的表達，這些早期過量探針膜雜交試驗實際上是現(xiàn)代膜雜交實驗的基礎。,上世紀60年代末，Britten等設計了另一種分析細胞基因組的方法。研究液相中DNA的復性以比較不同來源核酸的復雜度， 從不同生物體（細菌、酵母、魚和哺乳動物等）內(nèi)分離DNA，用水壓器剪切成長約450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液，經(jīng)煮沸使dsDNA熱變性成ssDNA。然后冷至約60，在此溫度孵育過程中，測定溶液一定時間內(nèi)的UV260nm的吸光度（減色效應）來監(jiān)測互補鏈的復性程度。 該實驗可比較不同來源生物DNA的復性速率，并可建立序列復雜度與動力學復雜度間的關系。,進入70年代早期，許多重要的發(fā)展促進了核酸雜交技術的進展。例如： 對特異基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析和對動力學雜交實驗的研究。 固相化的Poly U Sepharose和寡（dT）-纖維素使人們能從總RNA中分離Poly A+ RNA。 用mRNA的經(jīng)純化技術可從網(wǎng)織紅細胞總RNA中制備-和-珠蛋白mRNA混合物。這些珠蛋白mRNA首次被用于合成特異的探針以分析珠蛋白基因的表達。 由于制備cDNA探針很繁瑣，所獲得cDNA的長度和純度也不穩(wěn)定。所以尋求新的探針來源是使分子雜交技術進一步推廣的基礎。,70年代末期到80年代早期，分子生物學技術有了突破性進展。 限制性內(nèi)切酶的發(fā)展和應用使分子克隆成為可能。 各種載體系統(tǒng)的誕生，尤其是質(zhì)粒和噬菌體DAN載體的構(gòu)建，使特異性DNA探針的來源變得十分豐富。 人們可以從基因組DNA文庫和cDNA文庫中獲得特定基因克隆，只需培養(yǎng)細菌，便可提取大量的探針DNA。迄今為止，已克隆和定性了許多特異DNA探針。,由于固相化學技術和核酸自動合成儀的誕生，現(xiàn)在可常規(guī)制備18100個堿基的寡核苷酸探針。 應用限制酶和Southern印跡技術，用數(shù)微克DNA就可分析特異基因。 特異DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印跡和Northern印跡來測定，與以前的技術相比，大大提高了雜交水平和可信度。,2.2 核酸雜交原理 分子雜交(簡稱雜交，hybridization)是核酸研究中一項最基本的實驗技術。 應用核酸分子的變性和復性的性質(zhì)，使來源不同的DNA(或RNA)片段，按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與DNA鏈之間形成。,熒光原位雜交,2.2.1 制備樣品 首先需要從待檢測組織樣品提取DNA或RNA。 用限制性內(nèi)切酶消化DNA以產(chǎn)生特定長度的片段，然后通過凝膠電泳將消化產(chǎn)物按分子大小進行分離。 將含有DNA片段的凝膠進行變性處理，轉(zhuǎn)印到支持膜上并使其牢固結(jié)合。 RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然后轉(zhuǎn)印并交聯(lián)固定。,2.2.2 制備探針 探針是指一段能和待檢測核酸分子依堿基配對原則而結(jié)合的核酸片段。 作為探針的已知DNA或RNA片段一般為3050核苷酸長，可用化學方法合成或者直接利用從特定細胞中提取的mRNA。 在核酸雜交實驗中，探針需要被標記上可直接檢測的元素或分子。標記常用的為同位素標記法和生物素標記法。 通過檢測與膜上的核酸分子結(jié)合上的探針分子，既可知道被檢測的核酸片段在膜上的位置，也就是在電泳凝膠上的位置，也就知道了它的分子大小。,2.2.3 雜交 雜交方法又可分為液相雜交和固相雜交。 應用較多固相雜交：先將待測單鏈核酸樣品（如為雙鏈，則須先變性成為單鏈）結(jié)合到硝酸纖維素膜上，然后與溶液中標記探針進行雜交。 首先要進行預雜交，即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。 雜交過程中只需變性標記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應，然后洗去未結(jié)合的探針分子即可。,2.2.4 檢測 檢測的方法依標記探針的方法而異。 用放射性同位素標記的探針需要用放射自顯影來檢測其在膜上的位置； 用生物素等非同位素方法標記的探針則需要用相應的免疫組織化學的方法進行檢測。,第三節(jié) 核酸探針標記的方法,3.1 雙鏈DNA探針及其標記方法 3.2 單鏈DNA探針 3.3 寡核苷酸探針 3.4 RNA探針,核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為DNA和RNA探針； 根據(jù)是否使用放射性標記物的與否，可分為放射性標記探針和非放射性標記探針； 根據(jù)是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針； 根據(jù)放射性標記物摻入情況，可分為均勻標記和末端標記探針。,3.1 雙鏈DNA探針及其標記方法 分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。 雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。,3.1.1 切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時，E.coli DNA聚合酶就可將核苷酸連接到切口的3羥基末端。 該酶同時具有從53的核酸外切酶活性，能從切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3端補上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動，用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。 最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。,(2) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。 (3) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性，故應使用仔細純化后的DNA。,缺口平移標記示意圖 影響因素: (1) 產(chǎn)物的比活性取決于-32PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。,3.1.2 隨機引物合成法 隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。 合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。優(yōu)點： (1)Klenow片段沒有53外切酶活性，反應穩(wěn)定，可以獲得大量的有效探針。 (2)反應時對模板的要求不嚴格，用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進行反應。 (3)反應產(chǎn)物的比活性較高，可達4109 cpm/g探針。 (4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。,隨機引物標記示意圖,3.2 單鏈DNA探針 用雙鏈探針雜交檢測另一個遠緣DNA時，探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩(wěn)定,即形成自身的無效雜交，結(jié)果使檢測效率下降。 采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種: (1) 以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針; (2) RNA為模板, 用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。,單鏈DNA探針標記原理示意圖,3.2.1 從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針 合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬粒或M13噬菌體載體中，以此為模板； 以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物，在a-32P-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射標記探針； 反應完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內(nèi)或下游用限制性內(nèi)切酶切割這些長短不一的產(chǎn)物； 然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。 雙鏈RF型M13 DNA也可用于單鏈DNA的制備，選用適當?shù)囊锛纯芍苽湔溁蜇撴渾捂溙结槨?3.2.2 從RNA合成單鏈cDNA探針 用RNA為模板合成cDNA探針所用的引物有兩種: (1)用寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA，并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA 3末端序列。 (2) 可用隨機引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點，產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子，所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復雜得多，應預先盡量富集mRNA中的目的序列。 反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性后，RNA單鏈可被迅速地降解成小片段，經(jīng)Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈探針。,cDNA探針標記原理示意圖,3.3 寡核苷酸探針 利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種: 單一已知序列的寡核苷酸探針 多個簡并性寡核苷酸探針組成寡核苷酸探針庫。 單一已知序列寡核苷酸探針能與目的序列準確配對，可以準確地設計雜交條件。 單一已知序列探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交。,3.4 RNA探針 許多載體如pBluescript、pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子，它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別，合成特異性的RNA。 在反應體系中若加入經(jīng)標記的NTP，則可合成RNA探針。 RNA探針一般都是單鏈。,RNA探針具有單鏈DNA探針的優(yōu)點，又具有許多DNA單鏈探針所沒有的優(yōu)點： RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性，所以在雜交反應中RNA探針比相同比活性的DNA探針所產(chǎn)生信號要強。 RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制，所以用RNA探針進行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果好。,噬菌體依賴DNA的RNA聚合酶所需的NTP濃度比Klenow片段所需的dNTP濃度低，因而能在較低濃度放射性底物的存在下，合成高比活性的全長探針。 用來合成RNA的模板能轉(zhuǎn)錄許多次，所以RNA的產(chǎn)量比單鏈DNA高。 反應完畢后，用無RNA酶的DNA酶處理，即可除去模板DNA，而單鏈DNA探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA分離。,噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶不識別克隆DNA序列中的細菌、質(zhì)?；蛘婧松锏膯幼?，在異常位點起始RNA合成的比率很低。因此，當將線性質(zhì)粒和相應的依賴DNA的RNA聚合酶及四種rNTP一起保溫時，所有RNA的合成，都由這些噬菌體啟動子起始。單鏈DNA探針合成中，若模板中混雜其他DNA片段，則會產(chǎn)生干擾。 缺點：合成的探針是RNA，它對RNase特別敏感，應而所用的器皿試劑等均應仔細地去除RNase；另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA會合成極長的RNA，它有可能帶上質(zhì)粒的序列而降低特異性。,第四節(jié) 核酸分子雜交因素,4.1 核酸分子雜交促進劑 4.2 核酸分子雜交反應時間 4.3 不同的反應條件對分子雜交結(jié)果的影響,4.1 核酸分子雜交促進劑 惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。 對單鏈探針可增加3倍； 對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達100倍。 短探針不需用促進劑，因其復雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高 。,硫酸葡聚糖，廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。是一種多聚胺，平均分子量為500000。 聚乙二醇（PEG），常見的一種促進劑，分子量?。?0008000）、粘度低、價格低廉，不能完全取代硫酸葡聚糖。 使用促進劑時有必要優(yōu)化條件。在某些條件下5%10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%10% PEG則可產(chǎn)生很高的本底。 聚丙烯酸鈉鹽，多聚體促進劑，濃度為2%4%。與硫酸葡聚糖相比，優(yōu)點是價格低廉，粘度低（MW=90000）。,小分子化學試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。 酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復性技術，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應用也是有限的。 硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細胞而抑制RNase的作用。,4.2 核酸分子雜交反應時間 一般雜交反應要進行20h左右。 1966年，Britten和Kohne推薦用C0t 值來計算雜交反應時間。 C0t 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（C0）和反應時間（t）的乘積。 C0t =100時，雜交反應基本完成。 C0t=0，基本上沒有 雜交。,例：在液相雜交中未標記的DNA 400g/ml（按單股DNA每微克紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為9.6）， 如果反應時間為21h，對于未標記的DNA來說，C0t =9.621 =201.6， 雜交完成。 對標記DNA（濃度為0.1g/ml）來說C0t值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。,4.3 不同的反應條件對分子雜交結(jié)果的影響 (1) 根據(jù)雜交液的體積確定雜交的時間：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA在反應中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。 (2) 根據(jù)所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時，則在68雜交，而在50%甲酰胺溶液中時，則在42下雜交。,(3) 選用不同的封閉試劑：如Denhardts試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO， 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。 與Denhardts試劑相比，BLOTTO價格便宜，使用方便，可獲得同樣滿意的結(jié)果，但不能用于RNA雜交。 尼龍膜Denhardts試劑比BLOTTO能得到更高的信噪比。 對硝酸纖維素濾膜而言，通常在預雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。 對于尼龍膜，經(jīng)常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質(zhì)會干擾探針和目的基因的退火。,(4)根據(jù)需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度，許多雜交膜一起反應時，連續(xù)的輕微振蕩可獲得較好的雜交結(jié)果。 (5) 在雜交過程中加入其他化合物，如反應體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG， 雜交速度可增加約10倍。 檢測稀有序列時常用該方法，但它們有時會導致本底較高，并由于溶液的粘稠性而使操作困難。 除非在濾膜上含有的目的DNA量很少，或放射性探針的量有限，一般不用硫酸葡聚糖或PEG。,(6) 根據(jù)探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度，如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式（高濃度SSC）， 反之則選用非嚴緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低于雜交體解鏈溫度12-20的條件下進行。 解鏈溫度(melting temperature， Tm )是指在雙鏈DNA或RNA分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。 通常富含GC堿基對的序列比富含AT堿基對序列的Tm 溫度高。,(7) 根據(jù)標記探針的濃度及其比活性，選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。 (8) 在水溶液中雜交時，用6SSC或6SSPE溶液的效果都一樣。但在甲酰胺溶液中雜交時，應該用具有更強緩沖能力的6SSPE。 上述這些條件的改變，對雜交的結(jié)果有不同的影響，應根據(jù)研究的具體情況，選用適當?shù)姆椒ā?第五節(jié) 幾種常見的雜交,5.1 Southern雜交 5.2 Northern雜交 5.3 菌落雜交法 colony hybridization method 5.4 噬菌斑雜交法 plaque bybridization,5.1 Southern雜交 步驟: (1) 酶切DNA，凝膠電泳分離各酶切片段，然后使DNA原位變性。 (2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物（硝酸纖維素濾膜或尼龍膜）上。 (3) 預雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。 (4) 讓探針與同源DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。 (5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。,雜交流程示意圖,Southern雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素,包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。 在最佳條件下，放射自顯影曝光數(shù)天后，Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32P標記的高比活性探針的(109 cpm/g)互補DNA。 如果將10g基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交，曝光過夜，則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。,DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上有3種方法: (1)毛細管轉(zhuǎn)移 本方法由Southern發(fā)明，故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。優(yōu)點：簡單，不需要用其他儀器。 缺點：轉(zhuǎn)移時間較長，轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。,(2) 真空轉(zhuǎn)移 將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置于濾膜上，緩沖液從上面的一個貯液槽中流下，洗脫出凝膠中的DNA，使其沉積在濾膜上。優(yōu)點：快速，在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號比Southern轉(zhuǎn)移強2-3倍。缺點：如不小心，會使凝膠碎裂, 并且在洗膜不嚴格時，其背景比毛細轉(zhuǎn)移要高。,(3)電泳轉(zhuǎn)移 將DNA變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。 優(yōu)點:不需要脫嘌呤/水解作用，可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。 缺點：轉(zhuǎn)移中電流較大，溫度難以控制。通常只有當毛細管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無效時，才采用電泳轉(zhuǎn)移,5.2 Northern雜交 Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測對象為RNA，其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結(jié)構(gòu)，保證RNA完全按分子大小分離。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后與探針雜交。 變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。而不用NaOH，因為它會水A的2-羥基基團。,RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。 在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將標記物膠切下，上色、照像。 樣品膠則進行Northern轉(zhuǎn)印，標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5g/ml EB的0.1mol/L 醋酸銨中10min，在水中就可脫色。,在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。 從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化汞是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。,5.3 菌落雜交法 colony hybridization method 對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100200）進行克隆篩選時，可采用本方法。 將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板，第二個瓊脂平板表面鋪一張硝酸纖維素濾膜。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。 主平板應貯存于4直至得到篩選結(jié)果。,5.4 噬菌斑雜交法 plaque bybridization 噬菌體為載體進行DNA克隆繁殖時所常用的方法。 把基因組中含有特定堿基序列的噬菌體，通過核酸雜交，從多數(shù)噬菌體的噬菌斑中選出的方法。 將在瓊脂培養(yǎng)基上形成的噬菌體的噬菌斑，移于硝酸纖維素濾紙上，堿處理使噬菌體DNA變性； DNA固定于硝酸纖維素濾紙上，與用放射性同位素標記的特定的RNA或DNA片段進行雜交； 通過放射自顯影法來識別含有所需DNA序列的噬菌體的噬菌斑，并從原來的瓊脂培養(yǎng)基中選出與其對應的噬菌斑。,5.5 斑點雜交 （dot hybridization） 斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上，然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。 同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋，還可以得到半定量的結(jié)果。 簡便、快速、經(jīng)濟的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到，是研究基因表達的有力工具。 目的序列未與非目的序列分離，不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時，難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。,5.5.1 DNA斑點雜交 先將膜在水中浸濕，再放到15SSC中。 將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用鉛筆在濾膜上標好位置，將DNA點樣于膜上，每個樣品一般點5l(210g DNA)。 將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?5.5.2 RNA斑點雜交 與DNA斑點雜交類似，每個樣品至多加10g總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化） 方法：將RNA溶于5l DEPC水，加5l甲醛/SSC緩沖液（10SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8l點樣于處理好的濾膜上，烘干。,細胞標本處理技術可以簡化，不用提取和純化RNA。方法：用含0.5%Nonidet P40的低滲緩沖液對多種動物細胞作簡單處理，離心去掉細胞核和細胞碎片，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細胞質(zhì)提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性，不需加工直接點到硝酸纖維素膜上。本法可以快速檢測大量標本，而只需極少量的細胞（5104）或組織。 整個RNA實驗中，要防止激活內(nèi)源性RNase，有許多種預防措施，有一種是在樣品中加入核糖核苷氧礬基復合物（RVC）。,5.5.3 完整細胞斑點雜交 類似檢測細菌菌落，將整個細胞點到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。 有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。 可以用于篩選大量標本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交。 不適用于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產(chǎn)生高本底。,第六節(jié) 其他類型雜交介紹,6.1 固相夾心雜交 6.2 “電子”雜交 6.3 cDNA微陣列雜交（cDNA microarray hybridization） 6.4 液相雜交 6.5 差異基因篩選類雜交,6.1 固相夾心雜交 Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進一步的改進。夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優(yōu)點：樣品不需要固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測的信號。 固相夾心雜交需要兩個靠近而不互相重疊的探針，一個作固相吸附探針，另一個作標記檢測探針。樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)。需注意的是兩個探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號。,6.2 “電子”雜交 “電子”雜交(electronic hybridization)基本原理同染色體步移是相似的，所不同的只是用EST數(shù)據(jù)庫代替文庫，且主要用于全長cDNA克隆。 EST是長達200bp300bp的cDNA片段，世界各國的實驗室將分離得到的EST輸入一個公開的公共數(shù)據(jù)庫中。如果有了某個cDNA的一個EST后，可輸入EST數(shù)據(jù)庫中去搜索同這個EST有一段共序列的另一個EST，然后把這兩個EST裝配成長的EST，經(jīng)過多次拼接延伸，最后有可能得到一個全長cDNA序列。 此時可根據(jù)這個cDNA序列設計引物，在合適的cDNA文庫中作PCR，擴增出真正的全長cDNA分子。當然，在數(shù)據(jù)庫中搜索和拼接EST等是借助電腦和有關的軟件進行操作，所以稱之為“電子”雜交。,6.3 cDNA微陣列雜交（cDNA microarray hybridization） 將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點陣， 然后用混合的不同DNA探針與微點陣進行雜交。 利用熒光、化學發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術掃描微點陣上的雜交信息。它比差異雜交技術的效率高、速度快、成本低，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問世。其缺點是無法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。,6.4 液相雜交 液相雜交（solution hbridization）是指使變性的待測核酸單鏈與放射性核素標記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復合物。 反應結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后結(jié)和后在雜交分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。 液相核酸分子雜交類型有：吸附雜交、發(fā)光液相雜交 、 液相夾心雜交 、 復性速率液相分子雜交 等。,6.4.1 吸附雜交 6.4.1.1 HAP吸附雜交 羥基磷灰石層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法，在液相中雜交后，DNA：DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上； 通過離心使吸附有核酸雙鏈HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP； 然后將HAP置于計數(shù)器上進行放射性計數(shù)。,6.4.1.2 親和吸附雜交 生物素標記DNA探針與溶液中過量的靶RNA雜交，雜交物吸附到酰化親和素包被的固相支持物（如小球）上； 用特異性抗DNA：RNA雜交物的酶標單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應，加入酶顯色底物。 該系統(tǒng)可快速（2h）檢測RNA。,6.4.1.3 磁珠吸附雜交 Gen-Probe公司應用丫啶翁酯（Acridinium ester） 標記DNA探針、這種試劑可用更敏感的化學方法來檢測； 探針和靶雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽離子磁化微球體）上； 溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經(jīng)過簡單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學發(fā)光測定。,6.4.2 發(fā)光液相雜交 6.4.2.1 能量的傳遞法 用兩個非?？拷奶结槪粋€探針的一端用化學發(fā)光基團（供體）標記，另一個探針的一端用熒光物質(zhì)標記。 當探針與特異的靶雜交后，這些標記物靠得很近，一種標記物發(fā)射的光被另一種標記物吸收，并重新發(fā)出不同波長的光，調(diào)節(jié)檢測器使自動記錄第二次發(fā)射光的波長。 只有在兩個探針分子靠得很近時，才能產(chǎn)生激發(fā)光，因此這種方法具有較好的特異性。,6.4.2.2 丫啶翁酯標記法 丫啶翁酯標記探針與靶核酸雜交； 未雜交的標記探針分子上的丫啶翁酯可以用專門的方法選擇性除去，雜交探針的化學發(fā)光是與靶核酸的量成比例的。 缺點：敏感度低（1ng的靶核酸），僅適用于檢測擴增的靶序列，如rRNA或PCR擴增產(chǎn)物。,6.4.3 液相夾心雜交 6.4.3.1 親和雜交 在靶核酸存在下，兩個探針與靶雜交，形成夾心結(jié)構(gòu)。 雜交完成后，雜交物可移到新的管或凹孔中，在其中雜交物上的吸附探針可結(jié)合到固相支持物上，而雜交物上的檢測探針可產(chǎn)生檢測信號。 用生物素標記吸附探針，及125I標記檢測探針。這個系統(tǒng)的敏感性可檢測出4105靶分子，該試驗保持了固相夾心雜交的高度特異性。,6.4.3.2 多組合探針和化學發(fā)光檢測 第一類探針是未標記的檢測探針和液相吸附探針，它們有50個堿基長，其中含有30個細菌特異序列堿基和20個堿基的單鏈長尾； 第二類探針是固相吸附探針，它可吸附在小珠或微孔板上。未標記檢測探針的單鏈長尾用于結(jié)合擴增多體（標記探針），液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上。,典型的試驗可有25個不同的檢測探針和10個不同的吸附探針； 第一個標記檢測探針上附著很多酶（堿性磷酸酶或過氧化物酶），可實現(xiàn)未標記檢測探針的擴增，使用化學發(fā)光酶的底物比用顯色反應酶的底物敏感。 這個雜交方法用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質(zhì)?？剐缘臋z測，敏感性能達到檢測5104雙鏈DNA分子。,6.4.4 復性速率液相分子雜交 細菌等原生物的基因組DNA通常不包含重復順序，在液相中復性（雜交）時，同源DNA比異源DNA的復性速度要快，同源程度越多，復性速率和雜交率越快。 利用這個特點，可以通過分光光度計直接測量變性DNA在一定條件下的復性速率，進而用理論推導的數(shù)學公式來計算DNA-DNA之間的雜交（結(jié)合）度。,6.5 差異基因篩選類雜交 6.5.1 差異雜交（differential hybridization） 差異雜交又叫差別篩選(differential screening)，是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對應位置雜交信息以分離差異表達的基因。,適用于基因組不太復雜的真核生物（如酵母）表達基因的比較，假陽性率較低。 對基因組非常復雜的真核生物，則因工作量太大，表達的序列所占百分比較低（僅5左右），價值不大。,6.5.2 扣除雜交(subtractive hybridization) 扣除雜交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通過構(gòu)建扣除文庫(subtractive library)得以實現(xiàn)的。 扣除雜交法：除去那些普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。,例：T細胞受體(T-cellreceptor，TCR)編碼基因的分離 T細胞和B細胞來自共同的前體細胞，兩者都能夠識別特異的抗原。但與B細胞不同，T細胞不能識別游離的抗原，而只能識別展現(xiàn)在其它細胞表面的抗原。 T細胞的這種抗原識別特異性是由TCR基因決定的。TCR基因只能在T細胞中表達，而不能在B細胞中表達。,從T細胞mRNA制備來的單鏈cDNA，同大大超量的B細胞的mRNA在有利于發(fā)生DNA-RNA雜交的條件下保溫。 其結(jié)果便會出現(xiàn)這樣的情況： 所有的能夠在T和B兩類細胞中同時表達的T細胞基因的cDNA分子(約占98)，都能與B細胞的mRNA退火形成DNA-RNA雜交分子; 不能在B細胞中表達的、T細胞特有的cDNA(約占2)，不能形成DNA-RNA雜交分子，仍然處于單鏈的狀態(tài)。,將雜交混合物通過羥基磷灰石柱(hydroxylapatitecolumn)，于是DNA-RNA雜交分子便結(jié)合在柱上，而游離的單鏈cDNA則過柱流出。 回收T細胞特異的cDNA，轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA之后，與適當?shù)氖删w載體重組井轉(zhuǎn)染給大腸桿菌寄主細胞，這樣便得到了T細胞特異eDNA高度富集的扣除文庫。 再按照同樣方法制備扣除的cDNA探針，即被B細胞mRNA雜交扣除后所得的T細胞特異的cDNA探針，篩選文庫，可以分離到了T細的TCR基因。,6.5.3 抑制性扣除雜交（SSH） 該方法運用了雜交二級動力學原理，即豐度高的單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA，從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達到基本一致。 所謂抑制PCR，則是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)先于鏈間退火，從而使非目的序列片段兩端反向重復序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。,SSH自從在克隆基因的實驗中采用以來，其優(yōu)勢是非常明顯： （1）極大降低了假陽性率，SSH方法采用兩次扣除雜交和兩次PCR，保證了該方法具有較高特異性。據(jù)有關報道證明SSH方法假陽性率可降至6%; （2）高度靈敏性，由于在反應中將豐度不同的單鏈分子含量歸一化，保證了低豐度mRNA檢測成功; （3） SSH法在一次反應中，可同時分離出上百個差異表達的基因，這一點遠勝于DDRT-PCR和RAD。,第七節(jié) 原位雜交,7.1 原位核酸分子雜交技術的發(fā)展 7.2 原位分子雜交技術的基本方法 7.3 RNA原位核酸雜交 7.4 雙重原位雜交方法 7.5 原位雜交的PCR增敏法 7.6 原位雜交的CSA增敏法,原位核酸分子雜交技術簡稱原位雜交(in situ hybridization ISH)是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結(jié)合而形成雜交體； 然后再應用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡或電子顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位。,原位雜交已用于基礎研究如基因組圖，轉(zhuǎn)基因檢測，基因表達定位，核DNA和RNA的mRNA的排列和運輸，復制和細胞的分類。 臨床研究應用在細胞遺傳學，產(chǎn)前診斷，腫瘤和傳染性疾病的診斷，生物學劑量測定和病毒學的病原學診斷等。,7.1 原位核酸分子雜交技術的發(fā)展 1969年，美國耶魯大學Gall和Pardue創(chuàng)立原位雜交，他們用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。 與此同時，BuongiornoNardelli和Amaldi,John及其同事等相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位。 1970年，Orth應用3H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交技術檢出了病毒DNA在細胞中的定位。,1981年，Bauman等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。 1982年，Shroyer報道用2，4二硝基苯甲醛(DNP)標記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶標抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶組織化學的方法顯示雜交信號。 1983年，Brigat首先建立生物素標記的探針在組織切片上檢出了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細胞中的定位，生物素標記探針技術目前已被廣泛應用，特別是在病毒學和病理學的臨床診斷中。,1987年，地高辛標記的有關試劑及藥盒被投放市場，和其它非放射性標記物一樣，地高辛較放射性標記系統(tǒng)安全，方便、省時間。同時在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標記技術要優(yōu)越，地高辛標記法顯示的顏色為紫藍色(標記堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng))，有較好的反差背景，更有利于與免疫組織化學相結(jié)合，同時可以檢測基因表達。,7.2 原位分子雜交技術的基本方法 原位雜交技術的基本方法包括：雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；雜交；雜交后處理；顯示(visualization)：包括放射自顯影和非放射性標記的組織化學或免疫組織化學顯色。,7.2.1 固定 固定的目的是為了保持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，最大限度地保存細胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。 DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，取材后應盡快予以冷凍或固定。,(1)最常用多聚甲醛固定組織，因其不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，不會影響探針穿透入細胞或組織。 (2)醋酸-酒精的混合液和Bouins固定劑也能獲得較滿意的效果。 (3)mRNA定位，將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中12 h，冷凍前浸入15%蔗糖溶液置4冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。,(4)組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10 min，空氣干燥后保存在-70。如冰箱溫度恒定，在-70切片可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。 在病理學活檢取材時多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號； 石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交聯(lián)的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。,各種固定劑均有各自的優(yōu)缺點： 沉淀性(Precipitating)固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouins液、Carnoys液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。 戊二醛較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交聯(lián)，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。,7.2.2 玻片和組織切片的處理 7.2.2.1 玻片的處理 玻片包括蓋片和載玻片應用熱肥皂水刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24 h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24 h后蒸餾水沖洗、烘干、烘箱溫度最好在150或以上過夜以去除任何RNA酶。 蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放。,用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。 常用的粘附劑有鉻礬明膠液，其優(yōu)點是價廉易得，粘附效果較差。 多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴。 新粘附劑APES粘附效果好，價格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應用。,7.2.2.2 增強組織的通透性和核酸探針的穿透性 增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑(detergent)或稱清洗劑Triton X100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。 這種廣泛的去蛋白作用無凝可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存量和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應填為掌握。,7.2.2.3 減低背景染色 背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐和三乙醇胺中以減低靜電效應，減少探針對組織的非特異性背景染色。 預雜交是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減