動(dòng)物胚胎工程實(shí)驗(yàn),王子玉 84395381 逸夫樓3084,實(shí)驗(yàn)二 小鼠卵母細(xì)胞的體外受精,對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)、動(dòng)物生殖機(jī)理的研究及保護(hù)瀕危動(dòng)物、治療人類的不孕不育癥等具有重要意義 可望解決胚胎移植所需胚胎的生產(chǎn)成本及來(lái)源匿乏等關(guān)鍵問(wèn)題。可利用IVMIVFIVC體外大規(guī)模生 產(chǎn)高質(zhì)量的胚胎，建立工廠化生產(chǎn)胚胎的成套技術(shù)，以大量生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的胚胎，大大加速品種改良進(jìn)程。,體外受精的意義,能為動(dòng)物克隆和轉(zhuǎn)基因等其他胚胎生物技術(shù)提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料和必要的研究手段 充分挖掘優(yōu)良公母畜的繁殖潛力 評(píng)定家畜精子的質(zhì)量,1978年 英國(guó),由于正常受精過(guò)程的完成需要一個(gè)完全成熟的卵子和一個(gè)獲得受精能力的精子，且其受精后需對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)才能發(fā)育成為一個(gè)可移植的胚胎，因此，從廣義上講，體外受精技術(shù)又包含卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)、精子的體外獲能、體外受精、受精卵的體外培養(yǎng)等多項(xiàng)密切相關(guān)的技術(shù)。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉雄鼠的生殖器官的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)； 掌握從輸卵管上取成熟卵母細(xì)胞的方法； 掌握從附睪尾部取精子的方法、精子的體外獲能和體外受精方案、受精率的觀察。,二、實(shí)驗(yàn)器材和材料,1. 器材及藥品 體視顯微鏡，手術(shù)器械，1mL注射器，膠頭滴管，口吸管，CO2培養(yǎng)箱，水浴鍋，移液器，槍頭，塑料培養(yǎng)皿，記號(hào)筆，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、載玻片、蓋玻片。 0.1透明質(zhì)酸酶，卵母細(xì)胞操作液（M2），精子操作液和受精液（T6），胚胎培養(yǎng)液（CZB，有糖和無(wú)糖）、激素（PMSG和HCG），石蠟油。,2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,3-4周齡昆明系雌性小白鼠和8-12周齡雄鼠，自由采食飲水，控光一周以上，暗光時(shí)間20：00-6：00；光照時(shí)間6：00-20：00。,三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的獲取,超排方法：15：00腹腔注射PMSG10 IU/只小鼠。48小時(shí)后腹腔注射hCG10 IU/只。 注射hCG 后14-15h，利用頸椎脫臼法處死小鼠（方法同實(shí)驗(yàn)一），取輸卵管于M2操作液中，清洗兩次，在體視顯微鏡下用眼科鑷子撕開輸卵管壺腹部釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體團(tuán)，用口吸管吹打幾次，把COC團(tuán)分散開。,IVM卵母細(xì)胞（小鼠）,2體外受精,21 取附睪尾部精子 選取性成熟（8周）昆明白雄鼠，已通過(guò)交配實(shí)驗(yàn)證明其有受精能力，頸椎脫臼法殺雄鼠，打開腹腔，將附睪尾部和輸精管剪下，剔除脂肪，在實(shí)體顯微鏡下，用鑷子和針頭配合，擠出輸精管內(nèi)精子。針頭刺破附睪尾部上皮，擠壓出精子（圖2-1）。,大鼠（公）,22精子的洗滌,在小鼠上可省略（從附睪尾部取精子），但在大動(dòng)物上必需（射出精液），洗滌可除去獲能抑制因子、卵黃、甘油等。,23精子的獲能,馬上收集精子團(tuán)塊，置于1.5mL離心管中，加入1mL含10mg/mLBSA的 T6，輕微振蕩幾次，使精子團(tuán)分散開，用封口膜封口，于37.5，5CO2，95空氣，100 濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中孵育1.5h左右。,發(fā)展中的南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)中心,24精液品質(zhì)檢測(cè),主要檢測(cè)活力和密度，方法參考動(dòng)物繁殖學(xué)實(shí)驗(yàn)教程。,附：精液品質(zhì)檢查,精液品質(zhì)檢查 (semen quality measurement)是為了鑒別精液質(zhì)量的優(yōu)劣。評(píng)定的各項(xiàng)指標(biāo)，既是確定精液取舍、新鮮精液進(jìn)行稀釋保存的依據(jù)，又能反映雄性動(dòng)物飼養(yǎng)管理水平和其生殖器官的機(jī)能狀態(tài)。 因此，常用作診斷公畜不育或確定其種用價(jià)值的重要手段，同時(shí)也是衡量精液在稀釋、保存和運(yùn)輸過(guò)程中的品質(zhì)變化和處理效果的重要判斷依據(jù)。,指 標(biāo),精子活力 (motility) 精子活力是指精液中呈前迸運(yùn)動(dòng)的精子所占百分率，也稱活率。由于它與精子的受精能力直接相關(guān)，所以是評(píng)價(jià)精液品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。通常在采精后，精液處理前、后，冷凍精液解凍后和輸精前進(jìn)行檢查 精子密度 每mL中精子的數(shù)目（細(xì)胞計(jì)數(shù)板）,精子頂體異常率 (abnormal acrosome rate)： 精子頂體在受精過(guò)程中具有重要作用，一般認(rèn)為只有呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)、且頂體完整的精子才具有正常受精能力。,精子畸形率 (ASR)： 凡形態(tài)和結(jié)構(gòu)不正常的精子通稱為畸形精子。在正常精液中也有一定比例的畸形精子，但一般不會(huì)超20%。優(yōu)質(zhì)精液，精子畸形率不能超過(guò)如下數(shù)值:牛18%，水牛15%，羊14%，豬18%，馬12%，,25體外受精,將成熟的COC移入已經(jīng)平衡2h的受精滴中（T6+20mg/mL），加入適量體積的獲能精子，使精子密度在1106右，置于培養(yǎng)箱中孵育8h，觀察原核形成和第二極體排出，計(jì)算受精率。,體外受精質(zhì)量的評(píng)定,體外受精成功的判斷指標(biāo)： 精子穿透率 原核形成率 卵裂率 囊胚率 通過(guò)染色或胚胎培養(yǎng),3胚胎培養(yǎng),洗去精子，將胚胎換液于無(wú)糖CZB繼續(xù)培養(yǎng)。胚胎過(guò)阻斷之后（4cell）換為含葡萄糖的CZB，換液時(shí)間在有1/3的胚胎到達(dá)4cell后進(jìn)行，大約在受精后36h48h之間。 在受精后24h、48h、72h、96h各觀察一次，記錄2cell、4cell、桑椹胚、囊胚的發(fā)育情況。,四、作業(yè),1計(jì)算本實(shí)驗(yàn)的受精率、卵裂率和囊胚發(fā)育率。,2簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)。 3簡(jiǎn)述體外受精的步驟。,THANKS!,哺乳動(dòng)物正常體內(nèi)受精 為了提高動(dòng)物繁殖率，家畜體外受精技術(shù)在20世紀(jì)80年代初研究成功，并在近10年得到逐步完善。 體外受精（IVF）：指用經(jīng)特殊處理的精子在體外使卵母細(xì)胞受精的技術(shù)。經(jīng)IVF-ET所生的嬰兒稱試管嬰兒。,二、體外受精概述,發(fā)情周期觀察超排活體取卵（或屠宰場(chǎng)卵巢卵母細(xì)胞的體外成熟） 采精精液品質(zhì)檢測(cè)精子體外獲能 體外受精（或ICSI） 胚胎質(zhì)量檢測(cè)胚胎移植妊娠分娩,技術(shù)流程,卵子的收集和處理,體內(nèi)：（超排后從卵巢或輸卵管內(nèi)） 體外：屠宰場(chǎng)的卵巢 本實(shí)驗(yàn)用小鼠卵巢,Egg retrieval, detail view,未成熟卵母細(xì)胞,脫去卵丘的未成熟卵母細(xì)胞,GVBD,成熟的卵母細(xì)胞,IVM卵母細(xì)胞（小鼠）,放射冠,透明帶,卵質(zhì)膜,卵母細(xì)胞,極體,1,3,2,精子入卵的三道屏障： 擴(kuò)展的卵丘 透明帶 卵質(zhì)膜,弱精、畸精、少精癥患者的精子很難穿越三道屏障,卵 巢,卵巢大多呈卵圓形，都成對(duì)存在。 由于各級(jí)卵泡及排卵后出現(xiàn)的一系列變化，致使牛、豬卵巢表面凹凸不平。 卵巢位置是半游離的，系于卵巢系膜上。 豬：青年豬為橢圓形，較?。欢嗵ゴ魏蟪势咸汛疇?。,卵巢為實(shí)質(zhì)器官，實(shí)質(zhì)為各級(jí)卵泡，包括原始卵泡、初級(jí)卵泡、生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡。 原始卵泡數(shù)量很多，但能成熟的卵泡很少，絕大部分退化成為閉鎖卵泡。 成熟卵泡排出卵細(xì)胞后，形成紅體，隨后形成黃體。黃體退化后由結(jié)締組織填充，而成為白體。,2.1.1卵泡發(fā)育和排卵,卵巢皮質(zhì)部表層聚集著許多原始卵泡，由一個(gè)卵原細(xì)胞和周圍的單層扁平卵泡細(xì)胞組成。 成熟：隨著卵泡的發(fā)育，經(jīng)過(guò)初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡階段，卵原細(xì)胞經(jīng)過(guò)初級(jí)卵母細(xì)胞、次級(jí)卵母細(xì)胞，最終發(fā)育為卵子，由卵巢排出。,黃體及白體,子 宮,子宮是胎兒生長(zhǎng)發(fā)育和娩出的器官。 子宮 (uterus)大部分位于腹腔，少部分位于骨盆腔。背側(cè)為直腸。腹側(cè)為膀胱，前接輸卵管，后接陰道，借助于子宮闊韌帶懸于腰下腹腔。 子宮角子宮體子宮頸,牛的子宮,豬的子宮,2.卵子發(fā)生,卵子是受精的基礎(chǔ)，作為配子的一方，在卵泡中逐漸發(fā)育成熟。 精子：提供遺傳物質(zhì) 卵子：提供遺傳物質(zhì)，提供支持早期胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng),2.1卵子形態(tài)結(jié)構(gòu),哺乳動(dòng)物的卵子為圓球形，其直徑大小因所含的卵黃量不同，變異范圍較大，透明帶內(nèi)卵黃的直徑為80200um，為精子體積的1萬(wàn)倍。 家畜卵的直徑一般小于185um，牛為120140um，綿羊140185um，豬120170um。,2019/9/1,69,可編輯,雌性生殖細(xì)胞的分化、增殖、成熟全過(guò)程稱為卵子發(fā)生 (oogenesis)。 卵子發(fā)生起始于胚胎早期，由原始卵原細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂、減數(shù)分裂最后成為單倍體的卵細(xì)胞，持續(xù)時(shí)間很長(zhǎng)，一般在初情期以后開始，至受精過(guò)程中才能完成。,2.2卵子發(fā)生特點(diǎn),卵子發(fā)生和精子發(fā)生的過(guò)程很相似，都要經(jīng)過(guò)增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期三個(gè)階段，但與精子發(fā)生相比也有許多不同之處。 首先，卵原細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂的增殖形成初級(jí)卵母細(xì)胞 ，初級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩次減數(shù)分裂，每次分裂均生成大小不等的兩個(gè)細(xì)胞，小的稱為極體。多余的染色體被排出，最后形成一個(gè)成熟的卵子。,其次，哺乳動(dòng)物的卵原細(xì)胞分裂形成初級(jí)卵母細(xì)胞都是在胎兒出生以前或出生后不久完成的。 在動(dòng)物性成熟以前，卵母細(xì)胞不再增長(zhǎng)，停留在第一次減數(shù)分裂前期。 到性成熟以后，每個(gè)性周期都會(huì)有部分卵母細(xì)胞發(fā)育，但多數(shù)卵母細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中退化，只有少數(shù)卵母細(xì)胞發(fā)育到成熟并排卵。,卵母細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中要積累大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和遺傳信息，為胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和信息。 盡管哺乳動(dòng)物的胚胎是在母體子宮內(nèi)發(fā)育，可以直接吸收母體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不像鳥類、兩棲類、爬行類動(dòng)物的卵需要存貯大量的卵黃物質(zhì)，但一些母源性mRNA.tRNA.rRNA的合成還是必需的。,三、卵的采集及體外成熟（實(shí)驗(yàn)）,1.卵母細(xì)胞的離體采集 母畜屠宰后，在30min內(nèi)取出卵巢，放入盛有滅菌生理鹽水或PBS的保溫瓶?jī)?nèi)（2535）中，在3h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，然后按照下述方法進(jìn)行回收。 卵泡抽吸法： 用注射器套上1216號(hào)針頭，保持一定負(fù)壓，從卵泡的側(cè)面刺入，一次進(jìn)針可抽吸卵巢皮質(zhì)的多個(gè)卵泡。 卵泡解剖法： 用手術(shù)刀片將卵巢切為兩半，去掉中間的髄質(zhì)部分，露出卵泡，然后用刀片劃破卵泡，在培養(yǎng)液中反復(fù)沖洗，采集其中的卵母細(xì)胞。,（一）卵母細(xì)胞的采集方法,2.卵母細(xì)胞的活體采集 因從屠宰場(chǎng)收集得到的卵巢無(wú)法知道其系譜，且其種質(zhì)一般相對(duì)較差，所以卵母細(xì)胞的活體采集是通過(guò)體外受精技術(shù)生產(chǎn)良種胚胎的一種主要途徑。如今，活體采卵已成為當(dāng)今應(yīng)用體外受精和胚胎移植的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。 腹腔鏡法： B型超聲波法：,Egg retrieval, ultrasound image,GIFT procedure, gamete intrafal-lopian transfer, laparoscopy 配子輸卵管內(nèi)移植（GIFT）,（二）卵母細(xì)胞的篩選,只有周圍包被著完整卵丘（A級(jí)）或部分卵丘脫落（B級(jí)）、胞漿均質(zhì)并充滿于透明帶內(nèi)的卵母細(xì)胞才能進(jìn)行成熟與胚胎發(fā)育的培養(yǎng)。,（三）卵母細(xì)胞的體外成熟方法,37-39度，5二氧化碳，100濕度 1.成熟培養(yǎng)液的選擇 基礎(chǔ)培養(yǎng)液TCM199中的核苷、黃嘌呤和次黃嘌呤等對(duì)卵母細(xì)胞核成熟有抑制作用的成分濃度較低，培養(yǎng)的效果相對(duì)較好。 體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞還要在基礎(chǔ)液加入一定濃度的血清（510的FCS或ECS）和促性腺素（0.11.0g/ml FSH和510g /ml LH等）等成分。 2.成熟培養(yǎng)的時(shí)間 對(duì)大多數(shù)家畜來(lái)講，卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)時(shí)間一般采用2224h，但是也要依據(jù)動(dòng)物而定。,3.成熟培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境 溫度：目前，除人和嚙齒類動(dòng)物的卵母細(xì)胞體外成熟仍采用37外，牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)溫度均采用3839。 氣象環(huán)境： CO2的濃度：應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液中的碳酸氫鹽來(lái)定。由于目前培養(yǎng)液中NaHCO3濃度多為2530mmol/L，故一般都采用5的CO2。 4.成熟培養(yǎng)的系統(tǒng) 大致可分為三大類。 開放培養(yǎng)系統(tǒng)： 將12ml成熟培養(yǎng)液直接置于平面皿內(nèi)或五孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后放入50200枚卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，上面不覆蓋石蠟油。,微滴培養(yǎng)系統(tǒng)： 將成熟培養(yǎng)液先在組織培養(yǎng)皿中做成50500l的微滴，上覆石蠟油，然后將卵母細(xì)胞置于其中培養(yǎng)。 在一般情況下，這種培養(yǎng)液用在卵母細(xì)胞數(shù)量特別少的情況下采用。 密閉培養(yǎng)系統(tǒng)： 將卵母細(xì)胞置于含有12ml成熟培養(yǎng)液的試管中，加蓋膠塞，然后在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中培養(yǎng)；如若采用培養(yǎng)皿或微滴培養(yǎng)，則可將其裝入一個(gè)密閉的塑料袋內(nèi)。,IVF, in vitro fertilization, process,受精是兩性配子 (精子和卵子)相互作用，結(jié)合產(chǎn)生新的個(gè)體即合子(zygote)的過(guò)程。 通過(guò)受精，單倍體的雌、雄生殖細(xì)胞共同構(gòu)成雙倍體的合子(又稱受精卵)，合子是新生命發(fā)育的起點(diǎn)。 哺乳動(dòng)物受精部位：輸卵管壺腹部。,有極少數(shù)的精子到達(dá)輸卵管壺腹部。主要是由于精子從射精部位到達(dá)受精部位需要闖過(guò)三道關(guān)卡，即經(jīng)過(guò)三次篩選： 第一道關(guān)卡子宮頸。 第二道關(guān)卡子宮內(nèi)膜腺。 第三道關(guān)卡輸卵管壺腹部和峽部的連接部。,剛射出的精子不能穿入卵子，而只有在雌性生殖道內(nèi)度過(guò)一段時(shí)間之后，才獲得受精能力，稱為“獲能”(capacitation)。,三、精子獲能,精子獲能后，能釋放出一系列水解酶，可將包圍在卵子周圍的細(xì)胞和生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)和黏多糖)溶解出一條通路，便于精子進(jìn)入卵母細(xì)胞。 獲能過(guò)程先在子宮內(nèi)進(jìn)行，最后在輸卵管內(nèi)完成。,頂體反應(yīng)(acrosome reaction)：包裹精子頭部的質(zhì)膜、頂體外膜融合和破裂，釋放頂體內(nèi)含物的過(guò)程。 這一反應(yīng)是精子與卵子融合前必須經(jīng)歷的反應(yīng)之一，也是精子獲能后的必然結(jié)果。,四、頂體反應(yīng),受精過(guò)程始于精子與卵子相遇，兩性原核合并形成合子時(shí)結(jié)束，分為五個(gè)步驟： 精子穿過(guò)放射冠 精子穿過(guò)透明帶 精子穿過(guò)卵質(zhì)膜 原核形成 配子配合,五、受精的過(guò)程,原核形成,精子入卵后不久，頭部開始膨大，核疏松，核膜消失，失去固有的形態(tài)，最后在疏松的染色質(zhì)外又形成新的核膜，這種重新形成的核叫雄原核。 同時(shí)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，釋放第二極體。卵中的染色質(zhì)外又形成新的核膜，稱雌原核。,配子配合,雄原核和雌原核經(jīng)充分發(fā)育，逐漸相向移動(dòng)。在卵子中央，核仁和核膜消失，兩原核緊密接觸，然后迅速收縮，染色體重新組合，并準(zhǔn)備進(jìn)行第一次有絲分裂，形成一個(gè)稱為“合子”的單細(xì)胞胚胎。,第二節(jié) 體外受精,一、概述 二、精子的制備及獲能 三、卵的采集及體外成熟 四、體外受精的方法 五、體外受精質(zhì)量的評(píng)定 六、早期胚胎的體外培養(yǎng) 七、影響體外受精的因素,1998年我國(guó)首例試管嬰兒誕生10周年時(shí)，張麗珠與鄭萌珠在一起。北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院,2.歷史,1978年7月25日，第一例試管嬰兒Louise Brown在英國(guó)誕生，這是體外受精技術(shù)走向全面應(yīng)用的標(biāo)志性事件，是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上的一次偉大的革命。 而早在1878年，德國(guó)科學(xué)家Schenk就開始進(jìn)行哺乳動(dòng)物卵子體外受精的嘗試。 1890年，Heape用人工授精和體外受精技術(shù)研究兔的胚胎移植，胚胎可成功發(fā)育直至降生。,直至20世紀(jì)40年代，世界上也只有為數(shù)不多的科學(xué)家能成功的進(jìn)行哺乳動(dòng)物體外受精試驗(yàn)。美國(guó)的Pincus和日本的Yamane是這時(shí)期的代表。 美籍華人張明覺在1945年曾成功的進(jìn)行了兔體外受精，但在此后的5年里沒(méi)有能再重復(fù)出這一結(jié)果。這個(gè)時(shí)期的體外受精工作主要建立在經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上。,1951年，Chang和澳大利亞的Austin幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)只有在雌性生殖道內(nèi)停留一段時(shí)間的精子才能成功的與卵結(jié)合，進(jìn)行體外受精。精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)是體外受精史上的一個(gè)里程碑。 1959年，Chang利用體內(nèi)獲能處理的精子進(jìn)行體外受精實(shí)驗(yàn)，獲得世界上首例“試管動(dòng)物”試管兔，為哺乳動(dòng)物體外受精工程奠定了基礎(chǔ)。,1963年，Yanagimachi和Chang首次報(bào)道了成功進(jìn)行精子體外獲能的實(shí)驗(yàn)（金黃倉(cāng)鼠）。 1970年，Mukherjee和Cohen，小鼠。 1978年7月25日，第一例試管嬰兒Louise Brown在英國(guó)誕生（Steptoe和Edwards），這是體外受精技術(shù)走向全面應(yīng)用的標(biāo)志性事件，是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上的一次偉大的革命。,1989年，陳大元等首次成功進(jìn)行大熊貓精子體外獲能，體外獲能的大熊貓精子能與金黃地鼠卵子相互作用。 1990年，Miller和Ax相繼進(jìn)行了美洲虎和美洲豹的體外受精，并于同年獲得美洲虎體外受精后代。,80年代以來(lái)，由于對(duì)胚胎需求量的加大，促進(jìn)了家畜體外受精的研究，牛、羊、豬等相繼獲得了成功，國(guó)內(nèi)在80-90年代也在家畜上取得了成功。 現(xiàn)已將卵母細(xì)胞體外成熟體外受精早期胚體外發(fā)育，甚至冷凍保存結(jié)合在一起，建立工廠化生產(chǎn)胚胎的成套技術(shù)，以大量生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的胚胎。,與人工授精相比，體外受精所需精子數(shù)減少，精液利用率提高。,二、精子的制備及獲能,1.取精,大鼠（公）,2.精子的分離與制備是IVF的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),精液中的精子獲能抑制因子 冷凍精液中的防凍劑和蛋黃等成分 影響和干擾受精的完成 過(guò)多的留在受精液中的死精子, 懸浮法（swim up）： 是篩選高活力精子最為有效的一種方法。 玻璃棉（glasswool）過(guò)濾法： 該法可有效地濾除品質(zhì)較差精液中的死精子，大大提高精子的受精穿透率。,方法：, BSA/哌可（Percoll）密度梯度離心法： 采用不連續(xù)的BSA密度梯度可以分離得到形態(tài)正常的高活力精子。 離心洗滌法： 對(duì)于精子活力較好的精液可采用直接離心洗滌法制備用于體外受精的精子。,3.精子獲能原理,任何可導(dǎo)致精子被膜蛋白脫除，質(zhì)膜穩(wěn)定性下降，通透性增加和Ca2+ 內(nèi)流的處理方法，均能誘發(fā)精子的獲能。 精子獲能后發(fā)生一系列明顯變化，代謝活動(dòng)顯著增強(qiáng)，攝氧量增加2-4倍，運(yùn)動(dòng)速度加快，頭部膨大，極易發(fā)生頂體反應(yīng)。,體內(nèi)獲能：把精子送入結(jié)扎的子宮角或輸卵管中孵育, 與血清白蛋白的溶液長(zhǎng)時(shí)間孵育： 原理是血清中白蛋白具有很強(qiáng)結(jié)合膽固醇和鋅離子的能力，可除去質(zhì)膜中部分膽固醇和鋅離子，改變精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致精子獲能。 用高離子強(qiáng)度溶液處理精子： 精子表面的去能因子（被膜蛋白），當(dāng)用高離子強(qiáng)度溶液處理精子時(shí)，將從精子的表面脫落，從而導(dǎo)致精子獲能。 與含有卵泡液的培養(yǎng)液進(jìn)行孵育：,4. 精子體外獲能的方法, 使用鈣離子載體A23187： 直接誘發(fā)Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部，提高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而導(dǎo)致精子獲能。 使用肝素： 是一種高度硫酸化的氨基多糖類化合物，當(dāng)它與精子結(jié)合后，能引起Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部而導(dǎo)致精子的獲能。是一種接近于體內(nèi)獲能的生理性方法，已經(jīng)成為動(dòng)物體外受精應(yīng)用最廣的一種精子獲能方法。,四、體外受精的方法,體外受精的完成需要一個(gè)有利于精子和卵子存活的培養(yǎng)系統(tǒng)。 微滴法： 是在塑料培養(yǎng)皿中用受精液做成2040l的微滴，上覆石蠟油，然后每滴放入體外成熟的卵母細(xì)胞1020枚及獲能處理的精子（1.01.5）106個(gè)/ml，在培養(yǎng)箱中孵育624h。,四孔培養(yǎng)板法： 每孔加入500l受精液和100150枚體外成熟的卵母細(xì)胞，然后加入獲能處理的精子（1.01.5）106個(gè)/ml，而后在培養(yǎng)箱中孵育624h。,五、體外受精質(zhì)量的評(píng)定,體外受精成功的判斷指標(biāo)： 精子穿透率 原核形成率 卵裂率 囊胚率 通過(guò)染色或胚胎培養(yǎng),六、早期胚胎的體外培養(yǎng),對(duì)于一些采用非手術(shù)法將胚胎移植的家畜來(lái)說(shuō)，體外受精后的早期胚胎必須在體外培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚階段才能移植；而對(duì)于那些采用手術(shù)法移植胚胎的動(dòng)物，將受精卵培養(yǎng)成囊胚再移植，亦有可能提高移植妊娠率，因體外受精的胚胎并不是都能發(fā)育到囊胚階段。 因此，早期胚胎的體外培養(yǎng)是胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)中非常關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。,（一）胚胎體外培養(yǎng)的發(fā)育阻斷 隨著胚胎的發(fā)育，合子的基因開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，其代謝活動(dòng)逐步由母源的mRNA控制向合子本身的mRNA控制過(guò)渡，在這一過(guò)渡時(shí)期，胚胎對(duì)所處的環(huán)境條件特別敏感，稍有不適便表現(xiàn)出不可逆的發(fā)育阻斷。（門檻）,在進(jìn)行哺乳動(dòng)物胚胎體外培養(yǎng)時(shí)，若胚胎所處的條件不當(dāng)，就會(huì)出現(xiàn)體外發(fā)育阻斷，即早期胚胎停頓在某個(gè)特定時(shí)期，甚至不能發(fā)育。 在體內(nèi)正常的生理?xiàng)l件下，胚胎從輸卵管和子宮腺體壁吸取營(yíng)養(yǎng)，保證其正常的發(fā)育。 體外模擬動(dòng)物體內(nèi)的環(huán)境條件,發(fā)育阻斷的出現(xiàn)時(shí)間與合子基因啟動(dòng)的時(shí)間有關(guān)，而且發(fā)育阻斷的出現(xiàn)與否也是胚胎質(zhì)量和培養(yǎng)條件相互作用的結(jié)果，在一定的培養(yǎng)條件下，某些特定品系的多數(shù)胚胎不表現(xiàn)發(fā)育阻斷，而通過(guò)改善培養(yǎng)條件亦能提高通過(guò)發(fā)育阻斷的胚胎比率。 小鼠：2細(xì)胞 牛羊：8-16細(xì)胞 豬： 4細(xì)胞 人： 4-8細(xì)胞,使胚胎通過(guò)發(fā)育阻斷，一直是胚胎體外培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。 經(jīng)過(guò)多年的研究，與體細(xì)胞共培養(yǎng)是促使胚胎通過(guò)發(fā)育阻斷最為有效的途徑，而且隨著近幾年研究工作的不斷深入，胚胎發(fā)育阻斷也可以通過(guò)改善培養(yǎng)條件和在培養(yǎng)液中添加生長(zhǎng)因子（TGF和bFGF等）或細(xì)胞外基質(zhì)因子（如肝素纖粘蛋白）克服。,（二）培養(yǎng)液的基本成分及其功能 培養(yǎng)液的基本成分主要包括無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物和蛋白質(zhì)等，按其功能可分為滲透壓維持因子、代謝底物和代謝調(diào)節(jié)因子等。 1.無(wú)機(jī)鹽：培養(yǎng)液中主要包括Na+、Cl、K+、Mg2+、Ca2+、PO43、SO42和HCO3等。 2.能量底物：主要包括葡萄糖、乳酸鈉、丙酮酸鈉和谷氨酰氨等。,3.氨基酸：是蛋白質(zhì)合成的前體，也參與胚胎的能量代謝，就單一氨基酸的作用而論，天冬氨酸、天冬酰氨、甘氨酸、組氨酸對(duì)胚胎發(fā)育均起促進(jìn)作用，而半胱氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和頡氨酸起抑制作用。 4.維生素：它作為碳水化合物