基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助（30750014）；寧夏自然科學(xué)基金資助(NZ09118)作者單位：750004銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；寧夏回族自治區(qū)顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通信作者：孫濤，Email：活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白mRNA在大鼠島葉電點(diǎn)燃模型海馬中的表達(dá)張培松王峰劉慶祝徐文中齊江華劉錚孫濤【摘要】目的探討電點(diǎn)燃和單一電刺激大鼠島葉模型ArcmRNA在海馬中的表達(dá)及意義。方法雄性SD大鼠隨機(jī)分為點(diǎn)燃組、單一電刺激組、假手術(shù)組和正常對(duì)照組，每組按時(shí)間點(diǎn)分兩個(gè)亞組。點(diǎn)燃組：建立電刺激島葉慢性癲癇模型，按時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)后斷頭取腦，應(yīng)用RT-PCR進(jìn)行海馬ArcmRNA的檢測(cè)；應(yīng)用原位雜交進(jìn)行齒狀回ArcmRNA的檢測(cè)；單一電刺激組：只刺激兩次，余同點(diǎn)燃組；假手術(shù)組只是不行點(diǎn)燃刺激，余同點(diǎn)燃組；正常對(duì)照組不給予手術(shù)干預(yù)。結(jié)果單一電刺激組、假手術(shù)組和空白對(duì)照組在3h時(shí)ArcmRNA表達(dá)分別為0.720.14，0.750.16，0.710.14，顯著低于點(diǎn)燃組海馬組織中ArcmRNA的表達(dá)1.780.43（P0.05）；原位雜交細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：點(diǎn)燃后3hArcmRNA的表達(dá)為112.8個(gè)6.0個(gè)，顯著高于單一電刺激組、假手術(shù)組和空白對(duì)照組ArcmRNA的表達(dá)，分別為46.25個(gè)4.35個(gè)，45.25個(gè)6.23個(gè)，44.75個(gè)6.49個(gè)（P0.05）。結(jié)論島葉癲癇發(fā)作可引起海馬ArcmRNA表達(dá)增加；突觸可塑性在島葉癲癇中起著重要作用?！娟P(guān)鍵詞】島葉；活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白；點(diǎn)燃；突觸可塑性mRNAexpressionofactivity-regulatedcytoskeletal-associatedproteininthehippocampusinducedbytheinsular-kindledratsZHANGPei-song,WANGFeng,LIUQing-zhu,XUWen-zhong,QIJiang-hua,LIUZheng,SUNTao.DeparmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospitalofNingxiaMedicalUniversity,KeyLabofCraniocerbralDisease,NingXiaHuiAutonomousRegion,Yinchuan750004,ChinaCorrespondingauthor：SUNTao，Email：【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofArcmRNAininsularelectricalkindledandasingleelectricalstimulatedratsanditssignificance.MethodsMaleSDratsweredividedintokindledgroupandasingleelectricalstimulatedgroupandsham-operatedgroupandcontrolgrouprandomly,eachgroupisdividedinto2sub-groupsatdifferenttimepoint.Kindledgroup:toestablishchronicinsularelectricalkindledmodel,andthendecapitatetomakeRT-PCRofArcmRNAonhippocampus,andtoapplyInSituHybridizationofArcmRNAondentategyrus；Asingleelectricalstimulatedgroup:usethesamemethodtothekindledgroupwithonlytwiceelectricalstimulation.Sham-operatedgroup:usethesamemethodtothekindledgroupwithoutelectricalstimulation.Controlgroup:withoutsurgery.ResultsExpressionofArcmRNAinthehippocampusofasingleelectricalstimulatedgroupandsham-operatedgroupandcontrolgroupwere0.720.14，0.750.16，0.710.14,significantlylessthankindledgroupthatwas1.780.43（P0.01）at3h,theexpressionofArcmRNAwasnosignificantdifference(P0.05)among4groupsat6h；ArcmRNAinsituhybridization(cellcount)showedtheexpressionofArcmRNAinkindledgroupwas112.86.0,significantlyhigherthanasingleelectricalstimulatedgroupandshamoperationgroupandcontrolgroupthatwere46.254.35，45.256.23，44.756.49（P1h，連續(xù)刺激至少6d，直至出現(xiàn)5次級(jí)發(fā)作，視為點(diǎn)燃成功。以最后一次刺激為準(zhǔn)，然后在3、6h時(shí)無痛處死大鼠。發(fā)作強(qiáng)度按Racine分級(jí)評(píng)分：級(jí)：不動(dòng)、閉眼，面肌輕微痙攣；級(jí)：點(diǎn)頭；級(jí)：?jiǎn)蝹?cè)前肢陣攣；級(jí)：雙前肢陣攣；級(jí)：全身陣攣發(fā)作。三、標(biāo)本采集及保存各組大鼠按時(shí)間點(diǎn)乙醚麻醉，一部分?jǐn)囝^取腦，迅速剝離左側(cè)海馬組織，液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管，-80保存。一部分用PBS及多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定后取腦，4多聚甲醛后固定，蔗糖脫水，液氮中OCT包埋后保存于-80冰箱中。美國LEICA恒低溫切片機(jī)行左側(cè)半腦冠狀冰凍切片，片厚14m，行ArcmRNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。四、RNA提取及RT-PCR檢測(cè)ArcmRNA在左側(cè)海馬中的表達(dá)1按TRIzol法提取RNA。TRIzol由invitrogen提供。2RT-PCR：引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)2設(shè)計(jì)的Arc引物序列：上游引物：5-ACAGAGGATGAGACTGAGGCAC-3，下游引物：5-TATTCAGGCTGGGTCCTGTCAC-3，擴(kuò)增77bpDNA片段；內(nèi)參肌動(dòng)蛋白：上游引物：5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3，下游引物：5-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3，擴(kuò)增150bpDNA片段，以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。RT-PCR試劑盒購于promega公司，反應(yīng)體系為25l：AMV/Tfl5反應(yīng)緩沖液5l,dNTP混合物（每dNTP10mmol/L）0.5l，上下游引物10mol/L各1.5l，25mmol/LMgSO41l，AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/l）0.5l，TflDNA聚合酶（5U/l）0.5l，RNA樣品1g，加無核酸酶水至25l。反應(yīng)條件為：48，45min反轉(zhuǎn)錄，94，2minAMV反轉(zhuǎn)錄酶滅活RNA/cDNA/引物變性；9515s變性，5840s退火，7230s延伸共40個(gè)循環(huán)；72，7min總延伸。PCR產(chǎn)物鑒定：取2.5lPCR產(chǎn)物,4%瓊脂糖凝膠，100V電泳40min后觀察。電泳完畢后,將電泳凝膠置于SYNGENE凝膠圖像分析系統(tǒng)上分析，以Arc與肌動(dòng)蛋白的吸光度比值表示最終結(jié)果。五、ArcmRNA原位雜交原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，具體實(shí)驗(yàn)過程按試劑盒說明書操作。ArcmRNA胞質(zhì)染成棕黃色顆粒（圖5A箭頭），在高倍（400倍）顯微鏡下隨機(jī)選取齒狀回3個(gè)視野進(jìn)行單位面積細(xì)胞計(jì)數(shù)，以3個(gè)視野的平均數(shù)表示最終結(jié)果。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用sx表示，成組設(shè)計(jì)多組均數(shù)的比較用單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)；同組不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1癲癇發(fā)作：電刺激大鼠島葉后放閾為(648士139)A。點(diǎn)燃速度為(8.6土2.1)d。點(diǎn)燃大鼠最初表現(xiàn)為動(dòng)須、閉眼、面肌痙攣、節(jié)律性咀嚼，接著前肢抬起、抽搐隨即跌倒，最后以濕狗樣抖動(dòng)結(jié)束，發(fā)作時(shí)間持續(xù)約30s至幾分鐘。2腦電圖：點(diǎn)燃組大鼠背景腦電圖與正常腦電圖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.197，P0.05）；點(diǎn)燃大鼠腦電圖顯示慢波節(jié)律增多，間斷出現(xiàn)尖波、棘波（圖1B），并與濕狗樣抖動(dòng)動(dòng)作同步。AB圖1AlphaLab腦電同步記錄系統(tǒng)記錄大鼠腦電圖A：正常腦電圖B：級(jí)發(fā)作時(shí)腦電圖LFP：局部場(chǎng)電位（V）3腦電頻率場(chǎng)電位：點(diǎn)燃大鼠級(jí)發(fā)作時(shí)導(dǎo)致大腦神經(jīng)元異常和過度超同步化放電，使其腦電頻率明顯增加。與正常腦電頻率相比點(diǎn)燃大鼠級(jí)發(fā)作時(shí)腦電頻率增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1963.611，P0.01）。AB圖2AlphaLab腦電同步記錄系統(tǒng)記錄大鼠腦電頻率場(chǎng)電位A:正常腦電頻率，主要集中在56Hz內(nèi)B：點(diǎn)燃大鼠級(jí)發(fā)作時(shí)的腦電頻率，主要集中在2830Hz4海馬ArcmRNA的表達(dá)：RT-PCR結(jié)果(圖3，4)顯示：3h4組間ArcmRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.064，P0.01），其中點(diǎn)燃組與單一電刺激組、假手術(shù)組、空白組相比ArcmRNA表達(dá)在3h均顯著增高（P0.01）；6h四組間ArcmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.400，P0.05）；點(diǎn)燃組ArcmRNA表達(dá)在3和6h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.783，P0.01），3h表達(dá)明顯增高。M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1:ArcmRNA；2:肌動(dòng)蛋白mRNAA：空白組；B：點(diǎn)燃組3h；C：點(diǎn)燃組6h；D:單一電刺激組3h；E：?jiǎn)我浑姶碳そM6h；F：假手術(shù)組3h；G：假手術(shù)組6h圖3各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)間ArcmRNA擴(kuò)增后的電泳圖點(diǎn)燃組與其他4組及不同時(shí)間點(diǎn)比較ArcmRNA在3h均aP0.01圖4：各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬結(jié)構(gòu)區(qū)ArcmRNA的表達(dá)5齒狀回ArcmRNA的表達(dá)：原位雜交結(jié)果(圖5，6)顯示：3h4組間ArcmRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=204.692，P0.01），其中點(diǎn)燃組與單一電刺激組、假手術(shù)組、空白組相比ArcmRNA表達(dá)在3