密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 根部特異性啟動子 擬南芥和棉花中 的 表達研究 of of I 摘 要 啟動子在基因表達調(diào)控中起關鍵性作用，它在很大程度上決定目的基因表達的時間、空間和強度。 當前商業(yè)化應用的 植物基因工程 產(chǎn)品大多使用的 是組成型啟動子，它們驅(qū)動外源基因在植物各種組 織和所有發(fā)育階段表達，這無疑增加了植物的代謝負擔，并造成物質(zhì)和能量的浪費，往往還會引起植物形態(tài)發(fā)生改變，甚至影響植物生長發(fā)育。因此，本研究 從煙草基因組中克隆根部特異性表達 因啟動子 分別與 因融合，轉(zhuǎn)化擬南芥和棉花，取得如下結(jié)果： 1構建成功 3 個植物表達載體： 帶 35s 啟動子驅(qū)動 因的表達盒； 帶 動子驅(qū)動 因的表達盒； 帶 動子驅(qū)動 因的表達盒。 2通過花沾法 將植物表達載體 入擬南芥 ， 分別獲得 再生植株 15 株和 16 株。 利用激光共聚焦 顯微鏡掃描 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗不同部位的熒光強度，結(jié)果表明， 動子驅(qū)動 因在根尖伸長區(qū)、成熟區(qū)以及根頸部優(yōu)勢表達，但其熒光強度比對照 動子低約 在莖、葉中基本不表達，說明該啟動子具有根組織特異性，但與 動子相比不是一個強啟動子。 3 通過花粉管通道法將植物表達載體 入陸地棉品種 ， 經(jīng) 卡那霉素篩選和 定，得到 轉(zhuǎn)基因植株 15 株。 用熒光定量 術檢測 動子驅(qū)動 因在部分單株根組織中的相對表達量，結(jié)果表明 啟動子片段 驅(qū)動 因在棉花根組織特異表達，但單株表達水平均低于對照 5S 啟動子，與擬南芥中的檢測結(jié)果一致。葉綠素含量測定結(jié)果表明，在根部特異性表達 因?qū)D(zhuǎn)基因棉花葉綠素含量變化的影響較小。 本論文分析 了 來源于煙草的 動子在 擬南芥及棉花中表達的組織特異性 ， 驗證了該啟動子在植物根組織中具有優(yōu)勢表達特性，并與 因融合，提高了轉(zhuǎn)基因棉花的耐澇性， 為 用于植物根組織的基因工程改良研究打下了基礎，并 對增強植株吸收水分，肥料及微量元素、有效抵抗 土傳 病蟲害以及在特殊生態(tài)環(huán)境下生存 均 具有 一定 的實際意義。 關鍵詞 : 動子 ，擬南芥 ，棉花 ，根 an in of as in in of by of in be as 1、 2、 15 6 1 by FP in of is no in is a it is an 3、 18 by 15 by CR of by in by in is is of of on of In of in to to in it to be in of to as as in 錄 第一章 緒論 . 1 對于高等植物具有重要的生理意義 . 1 的主要生理功能 . 1 良高等植物根的性狀具有重要意義 . 2 動子研究進展 . 5 述 . 5 動子的一般結(jié)構 . 6 物啟動子 的分類和應用 . 9 動子的選擇和改造 . 14 因及其啟動子研究進展 . 14 物遺傳轉(zhuǎn)化方 法 . 14 桿菌介導法 . 15 因槍法 . 15 粉管通道法 . 16 物遺傳轉(zhuǎn)化存在的問題與對策 . 17 基因植物的檢測技術 . 18 基因整合狀況的檢測 . 18 源基因表達特征的檢測 . 19 色熒光蛋白 . 20 色熒光蛋白的結(jié)構與特點 . 20 色熒光蛋白的種類 . 21 色熒光蛋白作為標記分子的優(yōu)點 . 21 色熒光蛋白的應用 . 22 研究的目的意義 . 22 研究的研究方案 . 23 第二章 植物表達載體的構建 . 24 料與方法 . 24 驗材料 . 24 法 . 25 果與分析 . 29 草 動子根部特異性順式元件的獲得 . 29 礎質(zhì)粒的酶切圖譜及鑒定 . 34 質(zhì)粒載體的構建及其鑒定 . 35 結(jié) . 40 第三章 擬南芥轉(zhuǎn)化及 因表達分析 . 41 料與方法 . 41 料 . 41 法 . 41 果與分析 . 43 南芥轉(zhuǎn)化 . 43 性轉(zhuǎn)基因植株的 定 . 43 基因擬南芥中 達分析 . 44 結(jié) . 47 第四章 利用 動子驅(qū)動 因在棉花中的表達分析 . 48 料與方法 . 48 料 . 48 法 . 49 果與分析 . 54 粉管通道法轉(zhuǎn)化棉花 . 54 基因后代篩選 . 54 性植株的 測 . 54 因表達量的熒光定量 析 . 55 澇對轉(zhuǎn) 因棉花相關性狀的影響 . 57 結(jié) . 60 第五章 結(jié)論 、創(chuàng)新點及討論 . 61 論 . 61 新點 . 61 論 . 61 物基因工程研究中啟動子的選用和改造 . 62 光定量 術檢測基因的表達量 . 62 參考文獻 . 63 致謝 . 74 作者簡歷 . 74 V 縮略詞表 35S P 5S 椰菜病毒 35S 啟動子 芐青霉素抗性 那霉素抗性 硫酸鏈霉素 魚堿合成酶基因終止子 I 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 光值 合酶鏈式反應 乙二醇 二烷基磺酸鈉 時熒光定量 色熒光蛋白 明顫菌血紅蛋白 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 外源基因在植物中表達調(diào)控的研究是植物基因工程的重要內(nèi)容。啟動子在基因表達調(diào)控中起著關鍵性的作用，它在很大程度上決定著目的基因 表達的時間、空間和強度。目前大規(guī)模商業(yè)化的雙子葉植物基因工程產(chǎn)品中廣泛應用的啟動子是 啟動子，它驅(qū)動外源基因在植物的各種組織 和所有發(fā)育階段都會表達 (et 1985； et 1990； et 1990；et 1990； et 1994； et 2002)。 這無疑增加了植株的代謝負擔，并造成物質(zhì)和能量上的巨大浪費 ，往往還會引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。 因此，用特異性啟動子 取代組成型啟動子，使外源基因能夠定時、定點、定量地在植物中表達，成為植物基因工程研究的重要內(nèi)容，并且取得了可喜的進展。 高等植物細胞分化的本質(zhì)在于不同基因差異表達的結(jié)果，多數(shù)發(fā)育調(diào)節(jié)基因的表達都具有時間性和空間性。時間性指的是特定基因的表達是不連續(xù)的，短暫的；空間性則是指特定基因具有在生物體內(nèi)特定部位表達，即組織特異性表達的特性。采用分子生物學手段對農(nóng)作物進行遺傳改良的過程中，常常希望限制外源基因只在特定的組織中表達，從而使植物在獲得目標性狀的同時，其它性狀基本不受影響或影響很小，這就需要通過有效的組織特異 性啟動子對靶基因的表達進行調(diào)控。植物基因工程研究的重要內(nèi)容之一就是用特異性啟動子取代組成型啟動子，使外源基因能夠定時、定點、定量的在植物中表達，這樣既可以滿足植物分子育種的需要，又可以減少植株代謝負擔，避免物質(zhì)和能量的巨大浪費。 高等植物的根不僅是植物體進行營養(yǎng)物質(zhì)和水分吸收、運輸、儲存與合成的重要器官，而且是抵抗病蟲害和在特殊生態(tài)環(huán)境中得以生存所不可缺少的組成部分，在高等植物的整個生命過程中行使著十分重要的生理功能。 本論文的主要研究內(nèi)容是分離根部特異性表達順式用元件，并驅(qū)動 因在擬南芥和 棉花中表達，為外源基因在植物根部，尤其是棉花根組織中高效表達提供有力的調(diào)控元件和分子工具，以利借助基因工程的方法，增強植株對水分，肥料及微量元素的吸收、有效抵抗病蟲害以及在特殊生態(tài)環(huán)境下生存。下面對相關研究領域的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分別進行簡要綜述。 對于高等植物具有重要的生理意義 根是植物體重要的營養(yǎng)器官，除少數(shù)氣生根外，絕大部分植物的根生長在地下，他們以其各級分枝形成龐大的根系，合理地分布在土壤的四周和深處。在植物的生命活動中，根擔負著許多重要的生理功能，對地上器官起著許多不可替代的作用。 的主要生理功能 收、輸導、合成與貯藏功能 吸收作用是根的主要生理功能，它是指根對土壤中的水分以及溶解在其中的離子狀態(tài)的礦質(zhì)元素、少量含碳有機物、可溶性氨基酸和有機磷，以及溶于水中的 物質(zhì)的吸收。根系吸水的主要部位在根尖。依據(jù)根尖細胞的結(jié)構特點，可以把根尖分為根冠、分生區(qū)、伸長區(qū)和中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 根毛區(qū)，吸收水分最活躍的部位是在根毛區(qū)。根所吸收的物質(zhì)可通過根中的輸導組織運往地上部分，又可接受地上部分所合成的營養(yǎng)物質(zhì)，以供根的生長和種種生理活動所需，其中一部分還可貯藏在根部的薄壁組織內(nèi)。 另外 ，根有很強的合成功能，它直接參與植物體內(nèi)有機物的合成。根所合成的有機物對地上部分的生長發(fā)育會產(chǎn)生重大影響，主要表現(xiàn)為通過促進或抑制根系活動，調(diào)節(jié)和控制地上部分的生長和發(fā)育。如根吸收的無機鹽并不是不加變化地運輸?shù)降厣掀鞴?，而是有相當一部分先在根?nèi)初步轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C物再向上運輸。如根所吸收的 30%50%在根內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C態(tài)氮，如氨基、酰胺、多肽或生物堿等。根也是合成植物激素的重要場所之一，如細胞分裂素是在根尖合成，生長素、脫落酸、赤毒素、乙烯等都可以在根中形成。當病菌等異物入侵植株時，根亦 和其他器官一樣，能合成被成為“植物保衛(wèi)素”的一類物質(zhì)，起一定的防御或減災的作用。 著與支持功能 植物的地上部分能夠穩(wěn)固地直立于地面，主要是由于根在土壤中的固著和支持作用。根有主根、側(cè)根、不定根之分，這些根又有各級分枝，形成龐大的根系，在土壤中廣泛分布。其分布范圍及深度與地上部分相應，再加上根內(nèi)牢固的機械組織和維管組織的共同作用，足以支持即使是十分高大的、分枝繁多的莖葉系統(tǒng)，并把它牢牢固著在常有風吹雨襲的陸生環(huán)境中。 泌功能 根有比較強的分泌作用，能分泌多種物質(zhì)，主要有糖、氨基 酸、有機酸、糖苷、維生素、植物生長物質(zhì)、酶等，還能分泌一些礦質(zhì)鹽類。這些分泌物有的可以減少根在生長過程中與土壤的摩擦力，有的使根形成促吸收的表面，有的對他種生物是生長刺激物或毒素。如寄生植物列當，其種子要在寄主根的分泌物的刺激下才能萌發(fā)，而苦苣菜屬（ 頂羽菊屬（ 一些雜草的根能釋放生長抑制物質(zhì)，使周圍的植物死亡 就是所謂異株克生現(xiàn)象（ 有的根分泌物可抗病害，如發(fā)現(xiàn)抗根腐病的棉根分泌物中有抑制該病菌生長的水氰酸，不抗病的品種則無。還有的根分泌物 能促進土壤中一些微生物的生長，它們在根際和根表面形成一個特殊的微生物區(qū)系（某一特定地區(qū)植物種類的總體稱為區(qū)系），這些微生物對植株的代謝、吸收、抗病性等方面起作用。 根的分泌作用可改善土壤的營養(yǎng)條件，如根分泌的 有機酸能使土壤中的一些難溶態(tài)礦物質(zhì)溶解，以利于根系吸收；根所分泌的酶能催化土壤中復雜的有機物，使之轉(zhuǎn)化為簡單的無機物供植物利用。根的分泌功能在植物與植物、植物與微生物之間的關系中起重要作用。例如，根所分泌的糖、氨基酸和有機酸等是微生物的重要營養(yǎng)和能量來源，反之，土壤微生物的良好活動又對植物生長的 環(huán)境和條件產(chǎn)生多方面的影響。另外，根的分泌作用對其它植物也產(chǎn)生一定的影響，如某種植物根所分泌的物質(zhì)對另一種植物的生長起抑制作用或促進作用等，所以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上采用連作、輪作、間作或套種時，要考慮根的分泌作用。 良高等植物根的性狀具有重要意義 自然環(huán)境復雜多變，逆境脅迫以及病蟲害侵害等是危害植物生長發(fā)育的主要因素。對于農(nóng)作物來說，增強其抵御逆境脅迫和病蟲害的能力、改善其吸收功能等能達到災年少減產(chǎn)甚至不減產(chǎn)中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 的目的，具有十分重要的生產(chǎn)價值。同時，提高農(nóng)作物對自然環(huán)境特別是土壤條件的適應性，也能夠擴大作物 的種植范圍，有效利用土地資源，對于我國這樣一個人均耕地面積缺乏的國家來說也具有十分重要的社會價值。 根除了行使上節(jié)所述的生理功能外，更是植物體抵御旱澇鹽堿、土傳病蟲害等不良因素首當其沖的植物器官。因此為植物的根組織定向的引入有益的目的性狀，增強其生理功能和抵御逆境脅迫和病蟲害的能力，具有十分重要的意義。 強根的抗?jié)承?作物受澇而萎蔫并不是因為水的問題，而是因為土壤通氣不足， 量增加而溶氧量減少，這樣短期內(nèi)使細胞呼吸作用減弱，繼而阻礙吸水；時間較長就形成無氧呼吸，產(chǎn)生和積累較多的酒精，根 系中毒受傷，吸水更少，因此作物受澇反而表現(xiàn)出缺水現(xiàn)象。如果能使高效的氧結(jié)合基因、分解酒精和轉(zhuǎn)化 基因或是適應低氧條件的水通道蛋白基因在目標作物中表達，就能有效增強作物的抗?jié)承裕瑴p少受澇對作物產(chǎn)量性狀和品質(zhì)性狀的影響，特別是對于不耐澇作物，如棉花、高梁等，具有重要的生產(chǎn)價值。 強根抵抗水分脅迫的能力 植物生長極易受環(huán)境非生物因子脅迫。其中陸生植物遭受脫水或水分脅迫主要來自于干旱、高鹽和低溫。植物只有對環(huán)境脅迫響應并適應這些環(huán)境脅迫才得以生存。水分脅迫誘導植物體內(nèi)發(fā)生各種生理生化反應，使植 物細胞生理脫水，導致植株生長停止、光合作用受抑、呼吸紊亂、整個代謝異常，最后植物表現(xiàn)出受害癥狀。 根部有吸水的能力，而土壤也有保水的本領。植物只能利用土壤中的可利用水分 自由水，實際上植物是在和土壤爭奪水分。干旱條件下，可利用水分就更少了。水分的吸收和運輸是從高水勢到低水勢，根系從土壤中吸水，根部細胞的水勢必須低于土壤溶液的水勢。高鹽條件下，土壤溶液中鹽分濃度高，水勢低于作物根部細胞，作物吸水困難，甚至失水萎蔫。 此外，大量的研究表明，干旱、低溫等水分脅迫與其他逆境如高溫、鹽漬、高光強、 一樣能引起植物體內(nèi)活性氧的積累，導致膜脂過氧化和蛋白質(zhì)、核酸等分子的破壞， 生物膜受損?；钚匝醣虐l(fā) (植物對生物或非生物脅迫響應的一個內(nèi)在特征。累積的活性氧造成質(zhì)膜損傷和膜透性增加是植物干旱傷害的本質(zhì)之一。因此，植物抗旱性與植物抗氧化能力密切相關，特別是與那些維持膜完整的脫毒酶和抗氧化物相關。 通過植物基因工程手段向根部定向?qū)?滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因，如脯氨酸合成酶基因、使植物在水分脅迫下能合成更多的代謝產(chǎn)物 ，有利于提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強植物的抗旱性。還可以 通過導入解毒酶和氧化脅迫相關的酶基因，使植物在滲透脅迫下過量表達一些酶 (如 ，以有效地排除活性氧自由基，保護和穩(wěn)定蛋白復合體和膜結(jié)構，從而提高細胞耐脫水的能力。 強抵抗土傳病害及地下害蟲的能力 病害是影響植物生長，導致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因之一。以棉花為例，危害棉花長勢和產(chǎn)量的病害以土傳病害為主，如表 1示。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 4 表 1花主要病害的傳播途徑及病癥 of 害 病原 侵染與傳播途徑 癥狀 立枯病 立估枯絲核菌 絲融合群 絲體和菌核在土壤中或病殘體上越冬，直接侵染棉籽、幼苗，種子帶菌，成為翌年初侵染源。 爛種、爛芽 ， 不能正常出土 。 接近土表的根莖部顯黃褐色斑點 ， 呈長條狀褐色凹陷 ， 向幼莖四周擴展 ，縊縮成蜂腰狀 ， 子葉萎垂 ， 幼苗倒伏枯死 。 韌皮部腐爛呈深褐色纖維狀等癥狀。 角斑病 棉角斑單胞桿菌 籽帶菌 ， 病菌科長時間存活在不易腐爛的病殘組織中 棉株在整個生育期中 ， 地上部分所有器官均可受害 ， 以葉部受害為重 。 受害后引起蕾鈴脫落 ， 嚴重時導致棉株死亡 。 黃萎病 大麗花輪支孢 病菌從根系經(jīng)表皮或根部傷口進入棉株 。 苗期很少發(fā)病 ， 在棉株生長中后期 ， 受害棉株葉片變黃 ， 干枯脫落 ，結(jié)鈴少 ， 脫落率高。 枯萎病 尖孢鐮刀菌?；?害棉花維管束 ， 屬土傳病害 。 菌絲從棉株根系的根毛或傷口入侵 ， 進入植物導管并擴散到棉株各部位 株型矮化 ， 直到枯死 。 木質(zhì)部呈黑褐色條文 。 感病棉株從苗期開始出現(xiàn)癥狀 ， 至現(xiàn)蕾盛期為發(fā)病高峰 ，呈現(xiàn)半邊枯死 ， 節(jié)間縮短 ， 植株矮小 ， 莖桿拐曲不直 。 葉深綠皺縮 ，增厚變脆等癥狀。 在眾多的病害中，尤以黃萎病危害嚴重。由于缺乏高抗黃萎病的陸地棉品種資源，且對黃萎病菌的致病機理及棉花抗黃萎病遺傳方式的了解較少，至今國內(nèi)外在棉花黃萎病的預防和抗病育種方面都沒有取得顯著進展。目前已經(jīng)通過基因工程的手段將一些廣譜抗菌和抗真菌 蛋白（如幾丁質(zhì)酶、 3葡萄糖氧化酶等）基因轉(zhuǎn)入棉花。但絕大多數(shù)獲得的基因工程抗性品種資源使用的是組成型啟動子（ 動子 ）。組成型啟動子具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空性，驅(qū)動基因在生物體的所有組織中表達，造成物質(zhì)和能量的浪費，而且對于某些抗病基因，如系統(tǒng)獲得性抗性相關基因，如果使其在農(nóng)作物的整個生育期和各個器官高效表達，產(chǎn)生強烈的超敏反應導致死亡，這樣就失去了抗病的意義。如果能使抗病基因在植物根部高效特異的表達，使根部具有持續(xù)高效的抗病能力，就能從源頭阻斷土傳病害的傳播和對植物的危害。因 此，根部高效表達的特異性啟動子將為增強植物根部的抗土傳病害的能力提供了有力的分子元件。 地下害蟲也叫土壤害蟲，是指生活在土壤中，并以作物地下部分 (包括播下的種子 )為主或作物近地面部分為食的害蟲，它是我國農(nóng)作物上的主要害蟲，水田、早地、丘陵、山坡地、林地、中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 5 果園、草原等均有發(fā)生。從春季到秋季，從播種到收獲，咬食植（作）物的幼苗、根、莖、種子及塊根、塊莖等。苗期受害，造成缺苗斷壟；生長期受害，破壞根系組織，使植株變黃，降低產(chǎn)量，影響品質(zhì)。同時地下害蟲為害造成的傷口常引起病原菌的侵染，使農(nóng)作物遭受更大的損失。目前以 化學防治為主導，使用的基本都是高毒、高殘留的乳劑、可濕性粉劑和顆粒劑等，用量大，利用率低、毒性大、污染環(huán)境。設想使抗蟲相關基因在根部持續(xù)高效表達并分泌到土壤中，在根系周圍土壤中形成抗蟲的微環(huán)境，能夠在植物整個生長過程有效防治地下害蟲且對環(huán)境無污染。 在增強營養(yǎng)物質(zhì)及礦物元素的吸收、合成和運輸中的生理作用 根是高等植物最重要的吸收器官，植物生長所需的各種營養(yǎng)成分、礦物質(zhì)、無機鹽、微量元素等絕大多數(shù)來自于根的吸收并轉(zhuǎn)化成植物可利用成分在運輸?shù)街参矬w的各個器官和組織。根的吸收能力的強弱直接影響到整 株植物的營養(yǎng)供給和其他器官和組織的生理機能。特異性的改善植物根部的吸收和運輸能力不僅能夠有效的維持地上部分的生理功能，加快植株的代謝和物質(zhì)合成速率，促進植物的生長發(fā)育，而且能夠使植物在貧養(yǎng)條件下充分吸收和利用有限的營養(yǎng)物質(zhì)，在生產(chǎn)上具有十分重要的意義。 于增強植物對土壤條件的適應性和改善土壤環(huán)境的作用 目前我國重金屬污染土壤的面積在逐漸擴大，程度不斷加深。通過基因工程手段向植物根部定向轉(zhuǎn)入從超積累植物中獲得的金屬硫蛋白 (植物鰲合肽 ( 金屬轉(zhuǎn)運蛋白等相關基因，能夠提高根部以及整 株植物對于高金屬含量土壤的抗性。同時能夠達到一定的去除污染和修復生態(tài)的作用。另外向根部導入特異性根分泌物相關基因，為植物基因型的遺傳改良、礦質(zhì)營養(yǎng)育種以及基因工程的應用提供了有效途徑。 動子研究進展 述 在細胞生長和分化過程中，遺傳信息的表達（由 錄為 譯為蛋白質(zhì)的過程）是嚴格地按照一定的時間順序和空間發(fā)生變化的，同時也表現(xiàn)出在細胞內(nèi)外環(huán)境的影響下進行著調(diào)整的過程。遺傳信息的表達調(diào)控表現(xiàn)在各個不同階段和水平，有轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄前后水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)譯水平的 調(diào)控和蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)水平調(diào)控等。通過研究表明，真核細胞基因表達的調(diào)節(jié)，一方面受控于基因調(diào)控的順式作用元件（ 另一方面同時受到一系列反式作用因子（ 調(diào)控，即具調(diào)控作用的蛋白質(zhì)因子。作用于真核細胞基因表達的順式作用元件由啟動子（ 節(jié)序列（ NA 成。生物體內(nèi)基因的表達，受到生物體內(nèi)外各種理化因素的調(diào)節(jié)控制，使生物能夠根據(jù)需要及環(huán)境的變化，定量、定時及定位地表達所 需的基因產(chǎn)物。植物細胞基因總數(shù)約為 4個，但在一定的發(fā)育階段、在某一類型細胞當中，則只有 15%左右的基因得以表達，產(chǎn)生約 6000不同的 子。具體而言，生物體在基因表達的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工、運輸及定位等各個環(huán)節(jié)都進行精細的調(diào)控，在這一系列過程中，涉及到啟動子、終止子、 列等調(diào)控元件，其中，啟動子的作用尤為重要，因此，對啟動子進行深入的了解，有助于更好地中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 6 控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達。 動子的一般結(jié)構 啟動子是指基因中一段可與 合酶及其其它一 些影響轉(zhuǎn)錄的反式作用因子結(jié)合而準確有效的起始轉(zhuǎn)錄的 列。它是基因準確和有效地進行轉(zhuǎn)錄所必需的結(jié)構。整個啟動子由核心啟動子和上游元件兩個部分組成。當 合酶定位并結(jié)合在啟動子上即可啟動轉(zhuǎn)錄過程，因此啟動子是基因表達調(diào)控的重要順式作用元件，它與 合酶以及其他蛋白輔助因子等反式元件的相互作用是啟動子調(diào)控模式的實質(zhì)。啟動子分三類：啟動子 I、啟動子 動子 有啟動子 導 轉(zhuǎn)錄。真核生物的啟動子 兩大部分組成：核心啟動子元件（ 上游 啟動子元件（ 心啟動子元件 ( 核心啟動子是在基因轉(zhuǎn)錄起始位點（ +1）及其 5上游近端大約 100 200內(nèi)的一組具有獨立功能的 列，每個元件長度約為 7 20決定 合酶 錄起始點和轉(zhuǎn)錄頻率的關鍵元件。核心啟動子單獨起作用時只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點和產(chǎn)生基礎水平的轉(zhuǎn)錄。真核生物基因啟動子的典型核心結(jié)構（ 約在轉(zhuǎn)錄起點 50 之間，具有結(jié)合并 控制轉(zhuǎn)錄起始前復合物的裝配、定位轉(zhuǎn)錄起始位點并控制轉(zhuǎn)錄的方向、對細胞內(nèi)臨近或遠處的激活子或抑制子做出響應的功能（ 2001），由 合酶 導轉(zhuǎn)錄的基因核心啟動子大多包含一個 和（或）起始子（ 轉(zhuǎn)錄起始子 有些第二類啟動子在轉(zhuǎn)錄啟始位點附近存在保守序列，這些位點提供最佳的轉(zhuǎn)錄起始，它們被稱為起始子（ 并且具有一致的保守序列，即 表嘧啶（ C 或 T），N 代表任何一個堿基，并且加下劃線的 A（腺嘌吟）是轉(zhuǎn)錄起始位點（ et 2000； et 1999； et 1998）。起始子與轉(zhuǎn)錄起始位點相重疊，其功能與 相似，能指導轉(zhuǎn)錄起始前復合物的裝配、決定轉(zhuǎn)錄起始位點并調(diào)節(jié)上游激活蛋白的活性。高等植物基因的轉(zhuǎn)錄起始位點通常位于翻譯起始密碼子（ 游 。大多數(shù)情況下（ 90%）轉(zhuǎn)錄起始位點周圍為嘌呤殘基， 分析了 61 種植物的翻譯起始密碼的序列后指出，植物 為 錄起始位點發(fā)生變化或缺失就會影響轉(zhuǎn)錄，但也有 學者認為該位點不足以成為轉(zhuǎn)錄的必須信號（ ， 1995）。 是第二類啟動子中最為典型的組件，保守序列為 常第五或第六個堿基由 T 代替 A。它約在基因轉(zhuǎn)錄起始點上游約 50，基本上由 基對組成，是決定基因轉(zhuǎn)錄起始的關鍵（ et 1981； et 2004），為 合酶的結(jié)合處之一，啟動子的活性取決于轉(zhuǎn)錄因子和 合酶組裝起來的前轉(zhuǎn)錄起始復合物。它在轉(zhuǎn)錄起始位點處組裝并啟動轉(zhuǎn)錄過程。在第二類啟動 子中， 作為接合蛋白因子組裝的起始位點。第一個與其接合的蛋白因子是 接合蛋白（ et 2004），隨后它在吸引接合中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 7 其它蛋白因子，直到組裝成前轉(zhuǎn)錄起始復合物，起始轉(zhuǎn)錄（ et 1997）。 是絕大多數(shù)植物啟動子正確啟動轉(zhuǎn)錄所必需的（ P， 1987；李一醌等， 1998），不含 的基因的精確轉(zhuǎn)錄受起始因子（ 導。 件并無一個十分嚴格的同源順序，其中最為關鍵的核昔酸是 +1 的 A 和 +3 的 T。 如果 5 N 為任意核苷酸）的兩側(cè) +4 到 +5 和 嘧啶，則成為強的 功能上與 類似，常常通過與 能介導上游至少一部分激活因子的調(diào)控作用，與 件與轉(zhuǎn)錄起點重疊。 游元件（ 較為重要的上游元件有兩種：一種是一般上游元件，如 和 ，