密級(jí)： 論文編號(hào) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 甜味蛋白 番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化研究 in in I 摘 要 甜度是番茄品質(zhì)性狀的一個(gè)重要指標(biāo)，人們?cè)谑秤梅褧r(shí)往往喜歡加一些蔗糖提高甜度，但吃糖過多不利于健康。因此，培育果實(shí)甜度高而含糖量不高的品種是番茄營養(yǎng)品質(zhì)育種的和多樣性育種的一個(gè)目標(biāo)?；蚬こ逃N是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有效途徑。甜味蛋白 一種高甜度、低熱量、天然、安全的新型甜味劑，與蔗糖不同，它不會(huì)引起齲齒、心血管疾病及糖尿病人的胰島素反應(yīng)。用 化番茄，不僅可以改善番茄的品質(zhì)，培育適合糖尿病人食用的番茄新品種，還可以以番茄作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)甜味蛋白，進(jìn)行甜味蛋白的商業(yè)化生產(chǎn)。本研 究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行番茄的遺傳轉(zhuǎn)化，在構(gòu)建 行了甜味蛋白在番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化研究，試驗(yàn)過程中得到的結(jié)果如下： 1、 建立了番茄轉(zhuǎn)化再生體系： 在 基礎(chǔ)上構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，根癌農(nóng)桿菌 導(dǎo)，葉盤轉(zhuǎn)化法建立了番茄轉(zhuǎn)化再生體系。篩選了適于番茄轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基的配方；確定了 100mg/l 的卡那霉素為番茄轉(zhuǎn)基因的最適抗性篩選濃度；明確了美味櫻桃番茄、中蔬 4 號(hào)和麗春為再生能力強(qiáng)、適于基因轉(zhuǎn)化的番茄品種，在轉(zhuǎn)化過程中始終以 100mg/l 卡那霉素進(jìn)行連續(xù) 的轉(zhuǎn)化苗的篩選工作，極大的減小了轉(zhuǎn)化植株的驗(yàn)證和栽培管理工作量，提高了轉(zhuǎn)化生根植株的陽性比率，在最后得到的所有生根植株中陽性株比率超過 90%。 2、克隆了 動(dòng)子并分析了其果實(shí)特異表達(dá)功能： 利用同源克隆的方法，從番茄紅瑪瑙 213 基因組中 法克隆到 1121啟動(dòng)子 列，構(gòu)建了由 動(dòng)子啟動(dòng)的 達(dá)載體 對(duì)它的功能進(jìn)行了驗(yàn)證， 獲得了美味櫻桃番茄轉(zhuǎn) 動(dòng)子基因材料 。對(duì) 基因番茄進(jìn)行了載體整合與表達(dá)的分析，通過基因組 證了 因的整合，一步 實(shí)了 因在轉(zhuǎn)基因成熟果實(shí)中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并且在果實(shí)中表達(dá)水平顯著高于 基因番茄?；蚍训母鹘M織器官和不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)經(jīng)組織化學(xué)染色后 因的表達(dá)表現(xiàn)出了果實(shí)發(fā)育階段特異性和組織特異性。上述結(jié)果證明了 一個(gè)可用于轉(zhuǎn)基因的果實(shí)特異性啟動(dòng)子。 3、合成了 因，并獲得了轉(zhuǎn)基因番茄材料： 通過 增合成了 碼基因，并對(duì) 因進(jìn)行了 T 克隆。構(gòu)建了 B和 個(gè)植物表達(dá)載體。 葉盤轉(zhuǎn)化法得 到了 中蔬 4 號(hào)和麗春 B 和 B 轉(zhuǎn)基因番茄植株。反轉(zhuǎn)錄檢測到了 因在轉(zhuǎn)基因果實(shí)中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因果實(shí)的甜度進(jìn)行了感官評(píng)價(jià)和可溶性含糖量的測定。轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的含糖量與野生型對(duì)照和 基因番茄對(duì)照相比沒有發(fā)生改變，但轉(zhuǎn)基因番茄的甜度顯著高于兩個(gè)對(duì)照。 關(guān)鍵詞：番茄，果實(shí)特異性 , 啟動(dòng)子，甜味蛋白， is of 00We in at by We a 8P1 a a in in o. 4 1、 of an We in as a to We 00mg/l in o4 i 00 mg/l in of to In 90% of 2、 of a We 13 121bp 8P1 US 8of NA of US in at a 5S:in of US 8US in 8P1 as an in 3、 in e CR a 162CR a T We We of at of 錄 摘 要 . . 一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 1 甜味蛋白 究進(jìn)展 . 1 味蛋白研究概況 . 1 內(nèi)外利用甜味蛋白基因轉(zhuǎn)化高等植物的研究進(jìn)展 . 5 2 番茄果實(shí)特異表達(dá)啟動(dòng)子 . 8 8 啟動(dòng)子 . 9 因啟動(dòng)子 . 9 G 基因啟動(dòng)子 . 10 成酶基因啟動(dòng)子 . 10 3 甜味蛋白 因轉(zhuǎn)化番茄的目的意義和前景展望 . 10 第二章 材料與方法 . 12 1 實(shí)驗(yàn)材料： . 12 茄試材 . 12 2 實(shí)驗(yàn)方法 : . 12 化體系建立及轉(zhuǎn)化載體和菌株 . 12 8動(dòng)子的功能驗(yàn)證 . 13 味蛋白 因的合成及其克隆 . 13 2.4 個(gè)轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建過程及方法 . 16 化植株的分子鑒定 . 20 3 生理水平上檢測轉(zhuǎn)基因植株的風(fēng)味變化和糖含量比較試驗(yàn) . 23 甜味蛋白番茄的品嘗試驗(yàn)設(shè)計(jì)： . 23 基因植株中影響番茄甜度的可溶性糖含量的測定： . 23 第三章 結(jié)果與分析 . 24 1 番茄轉(zhuǎn)化再生培養(yǎng)體系的建立 . 25 茄轉(zhuǎn)化再生培養(yǎng)流程圖 . 25 果分析 . 27 2 番茄果實(shí)特異表達(dá)啟動(dòng)子 克隆及功能研究 . 31 8序列 . 31 過構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體 化番茄驗(yàn)證 功能 . 32 3 因合成及克隆 . 36 成 因并進(jìn)行 克隆 . 36 得到的 克隆陽性菌落進(jìn)興酶切鑒定和測序 . 36 4 體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌 . 37 建好的 體圖 . 37 組陽性克隆的分子生物學(xué)鑒定 . 37 4.3 化到農(nóng)桿菌 . 39 5 甜味蛋白 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化 . 39 桿菌介導(dǎo)的番茄轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 . 40 第四章 討論 . 47 1 番茄轉(zhuǎn)化再生體系的討論 . 47 2 動(dòng)子果實(shí)特異表達(dá)功能分析 . 47 3 甜味蛋白基因?qū)Ψ训倪z傳轉(zhuǎn)化分析 . 48 第五章 結(jié)論 . 50 參考文獻(xiàn) . 51 V 圖 表 目 錄 表 1 七種甜味蛋白的特征 . 2 圖 1 果實(shí) . 3 圖 2 白骨架結(jié)構(gòu)上決定甜味活性的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn) , . 3 圖 3 體圖 . 18 表格 2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法 : . 24 表格 3 樣品中含糖量的測定方法 . 24 圖 4 番茄轉(zhuǎn)化再生培養(yǎng)流程 . 26 表格 4 度的篩選 . 28 表 5 三個(gè)番茄品種的轉(zhuǎn)化再生能力比較 . 28 圖 5 番茄轉(zhuǎn)化再生培養(yǎng)過程圖片 . 29 圖 6 番茄基因組 泳檢測圖 . 30 圖 7 測 化得到的轉(zhuǎn)化植株 . 30 圖 8 茄果實(shí)特異表達(dá)載體 . 32 圖 9 基因植株的基因組 定 . 33 圖 10 動(dòng)子果實(shí)特異性 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的一步 測 . 33 圖 11 組織化學(xué)方法檢測 35s 調(diào)控下 因在番茄葉片和果實(shí)中的表達(dá)比較 . 34 圖 12 轉(zhuǎn)基因支柱花藥中的表達(dá)檢測 . 34 圖 13 基因植株根部的表達(dá)比較 . 35 圖 14 在相同染色時(shí)間內(nèi) 化陽性株果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的染色效果 . 35 圖 15 成 因的編碼基因 圖 16 增鑒定 克隆 . 36 圖 17 酶切鑒定 重組質(zhì)粒 . 36 圖 18、 元表達(dá)載體圖 . 37 19 測轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的 性克隆 . 38 圖 20 35s 上游引物與 游引物 增鑒定 . 38 圖 21 酶切結(jié)果 . 38 圖 22 化到農(nóng)桿菌中的檢測 . 39 圖 23 化到農(nóng)桿菌中的檢測 . 39 表格 6 各種轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因番茄列表 . 40 圖 24 轉(zhuǎn)基因番茄的基因組 泳檢測結(jié)果 . 41 圖 25 一步 證 基因植株中 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá) . 41 圖 26 一步 證 轉(zhuǎn)基因番茄葉片中的積累 . 41 表格 7 第一次轉(zhuǎn)基因番茄甜度品嘗試驗(yàn)結(jié)果 . 42 表格 8 第二次轉(zhuǎn)基因番茄甜度品嘗試驗(yàn)結(jié)果 . 42 表格 9 手持測糖儀測定轉(zhuǎn)基因番茄可溶性糖含量結(jié)果 . 43 圖 27 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 . 44 表格 10 轉(zhuǎn)基因番茄可溶性糖含量分析 . 44 圖 28 A、 B 兩組轉(zhuǎn)基因番茄組內(nèi)單株間可溶性糖含量比較分析 . 45 圖 29 . 46 圖 30 邊緣序列的啟動(dòng)子元件結(jié)構(gòu) . 47 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 甜味蛋白 酸、甜、苦、辣、咸五味中甜味是最受歡迎的味覺，作為甜味劑的蔗糖一直是我們生活中不可缺少的甜味劑，然而蔗糖的過量攝入則會(huì)引起肥胖癥、齲齒、各種心血管疾病，及引發(fā)糖尿病人的胰島素反應(yīng)等癥狀。隨著人們生活水平的提高，上述癥狀越來越凸顯在現(xiàn)代人的生活中，人們對(duì)食品的要求也越來越高，找到一種蔗糖的替代品是甜味劑市場的迫切需要，因此從天然資源中尋找開發(fā)新型甜味劑自 20 世紀(jì) 70 年代以來一直受到人們的關(guān)注。而具有高甜度、低熱量天然安全特點(diǎn)的甜味蛋白，作 為一種新型甜味劑逐漸吸引了人們的視線，在已發(fā)現(xiàn)的七種甜味蛋白中有幾種已經(jīng)被開發(fā)為商品，并在歐美，日本等發(fā)達(dá)國家市場作為食品添加劑銷售。近年來，隨著植物分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，農(nóng)業(yè)科學(xué)家利用甜味蛋白高甜度的特點(diǎn)，將甜味蛋白基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物中，來改良農(nóng)作物的口感，隨著研究的不斷深入，甜味蛋白基因改良的作物將會(huì)為人們提供更多的可以放心食用的健康食品。 從六十年代以來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了七種甜味蛋白，他們分別是（ 972） 972） 989） 989） （ 968） 味蛋白），（ 1983） ( 1994)七種甜味蛋白分為三類： 1)甜蛋白：其蛋白本身就具有甜味，包括 2)甜味誘發(fā)蛋白： 有味調(diào)節(jié)功能，又名奇果蛋白，口含微量 3 分鐘后再喝 爾 /升檸檬酸即可產(chǎn)生甜味感覺 ,并且甜味可以持久達(dá) 2 個(gè)小時(shí)； 3)蛋白質(zhì)本身具有甜味，而且具有味調(diào)節(jié)功能，兼具甜蛋白和甜味誘發(fā)蛋白的性質(zhì)，且遇水時(shí)其可再次激發(fā)產(chǎn)生甜味。 目前研究的最多的甜味蛋白是 甜味蛋白的最大特點(diǎn)是他們大多甜度極高，大約是同濃度蔗糖的數(shù)百倍以上，并且這些甜味蛋白熱值低，迎合了當(dāng)前大眾對(duì)低熱量食品的消費(fèi)需要，并且甜味蛋白不像某些氨基酸甜味劑那樣會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)氨基酸不平衡，是食品飲料工業(yè)理想的甜味劑。但大多數(shù)天然甜味蛋白的最大缺點(diǎn)是，在高溫或 極端 件下會(huì)部分或全部喪失其甜味。表 1 是七種甜味蛋白的生物學(xué)特征，經(jīng)比較不難發(fā)現(xiàn)甜味蛋白 這七種甜味蛋白中分子量最小的單鏈蛋白，并且甜度是同濃度蔗糖的 2000 倍。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 表 1 七種甜味蛋白的特征 of 白名稱 甜蛋白 分子量 白肽鏈結(jié)構(gòu)及長度 酸結(jié)構(gòu) 相對(duì)甜度 來源 鏈 207 測 3000 T h a u m a t o c o c c u s 鏈 測 3000 鏈 114 測 550 鏈 測 500 鏈 測 100 鏈 191 測 遇酸變甜 鏈 54 測 2000 甜味蛋白 紹 甜味蛋白 穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性最好，最易溶于水的甜味蛋白，在威斯康馨大學(xué)由 (994)從一種西部非洲熱帶地區(qū)的攀緣灌木 通過靈長類動(dòng)物傳播種子，在原產(chǎn)地加蓬當(dāng)?shù)鼐用窈茉缇陀?1968）曾從 r. 一成果取得了 1994年的美國國家專利。 子量是 6473 道爾頓，等電點(diǎn)為 5，甜度為 2%蔗糖水溶液的 2000 倍， 子量是 12000 道爾頓，是蔗糖甜度的 500 倍， 沒有測序，還不能確定 98 擴(kuò)展 2 個(gè)小時(shí)后仍有甜味 (996)，產(chǎn)生的甜味可持續(xù)較長時(shí)間，比另一種甜味劑 甜味更接近于蔗糖。（ 996）對(duì) 多肽鏈序 列進(jìn)行了研究，指出 三種氨基酸序列， I、 4 個(gè)氨基酸殘基， ， 54 個(gè)氨基酸殘基的 該蛋白的主要組成成分， 有53 個(gè)氨基酸殘基，缺少一個(gè)氨基末端的 甜度是 54 個(gè)氨基酸 二倍。 別位于 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 間，這些二硫鍵決定了 白的穩(wěn)定性，它的空間結(jié)構(gòu)包括一個(gè) a 螺旋和三個(gè)反向平行的 折疊片層， (998)報(bào)導(dǎo) 可溶性結(jié)構(gòu)與已知的 構(gòu)不具相似性。在 白多肽鏈內(nèi)近七分之一的氨基酸為賴氨酸，所以 且可能是賴氨酸的 來源。 圖 1 果實(shí) 白結(jié)構(gòu)與甜味活性的關(guān)系 圖 2 白骨架結(jié)構(gòu)上決定甜味活性的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn) , of of to be of 圖注：標(biāo)出了決定 味活性的關(guān)鍵的氨基酸殘基的位置 突變會(huì)使甜度增加； 突變會(huì)降低甜度； 置的突變會(huì)極強(qiáng)的降低甜度， 會(huì)引起甜度變化。 構(gòu)與甜味活性的關(guān)系，（高廣華 1999）對(duì) 白分子中的半胱氨酸、賴氨酸、酪氨酸、組氨酸、和精氨酸進(jìn)行了化學(xué)修飾，修飾后的 度的降低或失去甜味，研究指出半胱氨酸對(duì) 白具有極為重要的結(jié)構(gòu)意義，半胱氨酸的還原和烷基化會(huì)導(dǎo)致級(jí)結(jié)構(gòu)的解體和三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，從而使 失甜味活性；除半胱氨酸外的其他氨基酸殘基的化學(xué)修飾也顯示具有決定 味活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，并推測 甜味活性中心：一個(gè)是以 a 螺旋和 折疊的 之中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 間的轉(zhuǎn)角為中心，包括分子中唯一的組氨酸 及 一個(gè)是以 折疊的 和 之間的 轉(zhuǎn)角為中心，包括 通過氨基酸突變研究 結(jié)構(gòu) ( 000)，當(dāng) 29 位的 為 甜味，然而突變第 30 位的 突變第 33 位的 會(huì)導(dǎo)致 味消失；在 轉(zhuǎn)角區(qū)域氨基酸的改變同樣會(huì)導(dǎo)致 去甜味活性， 41 位的 為 產(chǎn)生了所有氨基酸突變體中最高的甜度；但同時(shí)改變兩個(gè)氨基酸殘基則會(huì)大大 的降低 度；并在 29 和 36 氨基酸位點(diǎn)檢測主鏈和副鏈長度對(duì)甜度的影響，結(jié)果表明主鏈對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生甜味起主要作用，而副鏈的長度起次要作用；還發(fā)現(xiàn) N 和 C 末端對(duì)的生甜味也很重要。 通過改變 骨架結(jié)構(gòu) (000)，詳細(xì)指出了在 骨架結(jié)構(gòu)中特定位置的氨基酸的變化所引起的 度的變化。 序列與干擾昆蟲消化的植物蛋白相似，他的折疊方式同蝎子毒液中的毒素相似。 1998 年組織了一個(gè)研究小組研究 白的結(jié)構(gòu)， 研究中得到 15 個(gè) 似的蛋白質(zhì)，每一個(gè) 似蛋白都是沿著 基酸序列有一個(gè)氨基酸突變的突變體，氨基酸的改變影響了蛋白質(zhì)的構(gòu)型，進(jìn)而影響了蛋白質(zhì)的甜度；核磁共振技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)每一蛋白都采用與 同的折疊方式，除一個(gè)蛋白突變體形成支架結(jié)構(gòu)外，其他的蛋白突變體同狀相同。 14 個(gè) 似蛋白和天然 白及蔗糖 的味覺對(duì)比顯示， 14 個(gè)突變體中有 4 個(gè)突變體幾乎沒有甜味， 6 個(gè)突變體甜度顯著降低， 2 個(gè)突變體同 樣甜，并且是 合物甜度的兩倍。盡管 14 個(gè)突變體的形狀同 同，但是多肽鏈上氨基酸的改變?cè)斐傻逆溨g的差異影響了甜度；并發(fā)現(xiàn) 子中有兩個(gè)區(qū)域決定 甜味活性，這些區(qū)域內(nèi)的氨基酸變化均會(huì)引起 甜度變化，并指出這些區(qū)域可能和受體的結(jié)合有關(guān)； 甜味受體結(jié)合引發(fā)靈長類動(dòng)物的甜味感覺的機(jī)理還沒有報(bào)道，并且甜味受體還沒有分 離出來。 通過 變體研究 白的甜度與特定氫鍵完整性之間的關(guān)系（ 三個(gè)具有甜味表型的突變體具有相同的氫鍵，三個(gè)不甜的突變體在 在此打節(jié)，并缺少一個(gè) 間的氫鍵，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生扭曲；另有兩個(gè)不甜的突變體中缺少連接 N 和 C 末端的氫鍵，對(duì) 變體 的研究表明突變體的 N 末端和 C 末端較野生型的更為活躍。 外源生物中的表達(dá)研究進(jìn)展 天然來源及其 在一定溫度范圍內(nèi)和酸性條件下的穩(wěn)定性使其成為低卡路里甜味劑的理想選擇，在開發(fā)甜味蛋白的過程中，人工合成了 白，但人工合成的 L 型 D 型 有甜味。由于受成本的制約及 隨著人們對(duì)甜味蛋白認(rèn)識(shí)的加深， 自從上世紀(jì) 90 年代從 分離出 白，不斷有報(bào)道揭示了利用微生物表達(dá)系統(tǒng)和植物表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)工業(yè)用 可能性。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 設(shè)計(jì)編碼 基因（ 000），使用在大腸桿菌中表達(dá)的偏愛密碼子，人工合成 因，并在大腸桿菌中表達(dá)出 組蛋白質(zhì)，重組蛋白具有類似于天然甜味。 美國 司 1998 年宣布將利用轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)食用 味劑，要在玉米中低成本中提取 定甜味蛋白是正在發(fā)展的低卡路里甜味劑市場的理想產(chǎn)品，并計(jì)劃從 1 噸加工玉米中提取出 1 千克的 個(gè)量至少相當(dāng)于 1000 千克的糖。一些公司也正在開發(fā)將 因用于改良 生產(chǎn)鮮產(chǎn)品的農(nóng)作物中，但 司擁有對(duì)這種甜味劑提取的專利權(quán)。 2000）在商業(yè)計(jì)劃書中表示由于商業(yè)競爭的需要要求 玉米中高效表達(dá)，并且每噸玉米中提取的 白必須相當(dāng)于 500 千克糖。在已經(jīng)進(jìn)行的研究階段 可行性，得到的 白占總的可溶性蛋白的 研究階段 劃使用不同的啟動(dòng)子和信號(hào)肽及基因修飾等方法來提高基因的表達(dá)水平；另外 將開發(fā)轉(zhuǎn)基因玉米加工技術(shù)，從玉米中提取純化 化的 進(jìn)行味覺測試以確定適合商業(yè)生產(chǎn)的最適配方。 2