蘭州大學碩士研究生學位論文 1 體外共培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞對肝星狀細胞增殖的影響 前言 間充質干細胞 (初是由 1所發(fā)現(xiàn)的，它是干細胞家族重要的成員，來源于發(fā)育早期的外胚層和中胚層，是具有高度的自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。其廣泛存在于上皮、骨髓、軟骨、肌肉等眾多中胚層來源的組織器官中 2，在一定的條件下它可以分化為中胚層起源的多種組織細胞，如軟骨細胞、成骨細胞、肌肉、脂肪細胞、肌細胞、血管內皮細胞及神經(jīng)星狀細胞等。因其具有多向分化潛能、造血 支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點，并且避免了胚胎干細胞移植所帶來的免疫排斥反應及倫理問題，而日益受到人們的關注。目前， 骨髓來源的 且隨著供體年齡增長其擴增及分化能力會出現(xiàn)明顯的下降。近年來臍帶間充質干細胞（ 漸進入我們的視野， 從人臍帶中分離出 的胞含量、增殖 分化 能力 都 優(yōu)于 骨髓間充質干細胞（ ， 因其 免疫 細胞較幼稚，免疫功能不成熟，免疫 原性比 病毒、病原微生物感染率也較低， 并且 其 具有取材方便，無 社會、法律、 倫理學爭議等優(yōu)點 。有研究表明 其是流式檢測結果更是與骨髓、臍血等組織來源的 3。與成體階段與多種細胞共同生存的 所生長的組織環(huán)境更加單純，從而賦予了其更強的增殖能力與分化能力，強大的分泌因子能力、超低的免疫源性，大量的細胞來源、方便的提 取提純以及易于體外培養(yǎng)等特性，使 在慢性肝病的發(fā)展過程中，肝臟纖維化的形成是一個復雜而緩慢的過程，是繼發(fā)于各種慢性致病因素（如 ， 酒精性肝病、病毒性肝炎、某些代謝性疾病、肝寄生蟲病 、 藥物及化學毒物損傷等） 所 引起的反復的組織損傷、炎癥反應 以 及損傷修復的結果 。肝纖維化的 實質是 細胞外基質（ 的改變。 肝星狀細胞（ 是 主要來源 4， 它 是肝臟的一種非實質細胞，位于肝細胞與肝竇內皮細胞之間的竇周 隙內 。蘭州大學碩士研究生學位論文 2 激活是 肝 纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)， 肝臟 損傷時， 激活，轉化為肌纖維母細胞 (由于 成與消除速度不平衡， 而 造成量增加，產(chǎn)生 了 大量以 I 型膠原為主的 且 分 泌血小板源性生長因子 （ 、轉化生長因子 (等各種促 進 纖維化 的 因子， 從而 促進肝纖維化的形成 5。近年研究表明肝纖維化是可逆的過程， 其中肝星狀細胞的增殖活化的抑制是其關鍵。多項研究表明， 各種原因所致的肝臟損傷有明顯的修復作用，可以改善甚至逆轉肝纖維化 6 肝纖維化發(fā)生過程是一個復雜的級聯(lián)反應，各種原因所導致的肝實質細胞的損傷是 活的始動因素，再經(jīng)過一系列細胞因子的調控活化，如 成纖維細胞生長因子 ( 內皮素 (T)、白介素 白介素 瘦素(1結締組織生長因子 ( 8。這些細胞因子均通過相應的信號傳導通路作用于靶細胞，產(chǎn)生生物應答。作用于這些信號及其傳導過程或阻斷這些信號傳導級聯(lián)反應的重要環(huán)節(jié)可作為防治肝纖維化的重要策略。目前研究較為清楚的相關信號傳導通路主要有 、 導的 導通路、 路、 路及 路等。其中 是目前所公認的最重要的致肝纖維化的細胞因子 9。本研究進一步觀察 過 、凋亡的影響。 蘭州大學碩士研究生學位論文 3 材料與方法 驗材料 帶來自于甘肅省中醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，已向家屬告知，并簽署同意書。 星狀細胞 永生化人肝星狀細胞株，由美國 授惠贈。 1. 2 主要試劑與材料 養(yǎng)基、 胎牛血清（ ：購自 司 ； 胰蛋白酶：購自 司； 料：購自 司； 自 司； 劑盒：購自 R&D 公司； 熒光定量 劑盒：購自大連 司； 提試劑 自大連寶生物公司； 細胞裂解液：購自碧云天生物技術研究所公司； 購自 司； 光試劑盒：購自 司； 白濃度測定試劑盒：購自北京 司； 抗體、 體、 體：購自 司； 體：購自 司； 記的山羊抗兔 自 司； 其他試劑純度均為分析純。 25胞培養(yǎng)瓶、 6 孔、 96 孔培養(yǎng)板， 15心管及 100胞培養(yǎng)皿、 自 司； ：購自 司。 1. 3 主要試劑配制 酸鹽緩沖溶液（ ：在電子天平上分別稱取氯化鈉（ 8.0 g、氯化鉀（ 0.2 g、磷酸二氫鉀（ 州大學碩士研究生學位論文 4 g、磷酸氫二鈉（ 去離子水溶于 1000 量瓶中，定容至 1000 且在充分溶解后，高壓滅菌， 4冰箱內保存。 蛋白酶溶液：稱取胰蛋白酶粉末 于 100 杯中，攪拌均勻，過濾滅菌后，用 15心管分裝， 箱內保存。 %多聚甲醛：稱取多聚甲醛 2g，溶于 50ml ，加熱至 60，滴加 1l 的 顏色清亮，冷卻后補充 1004 冰箱內 保存 。 液 (5mg/稱取 入小燒杯中，加入 50電磁力攪拌機上攪拌 30完全溶解， m 的濾膜過濾除菌。 4 冰箱內 保存 。 離膠：去離子水 0:4 10%過硫酸銨 縮膠：去離子水 0:4 10%過鏻酸銨 l， l。 白電泳緩沖液：稱取 于 1L 去離子水中，備用。 膜緩沖液：稱取 去離子水 定容至 800入150醇， 去離子 水定容至 1000用 。 稱取 入 離子水定容至 1L， 至 入 1 1. 4 主要試驗儀器 胞培養(yǎng)箱：三洋公司； 倒置相差顯微鏡： 司； 超凈工作臺：蘇凈集團安秦公司； 高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠； 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司； 臺式高速離心機： 司； 低溫冰箱：海爾公司； 流式細胞儀： 司； 干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司； 電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司； 電子天平 ：上海梅特 勒 蘭州大學碩士研究生學位論文 5 酶標分析儀 ： 司； 移液槍： 司； 電泳儀 ： 司； 熒光定量 循環(huán)儀： 司； 曝光機： 司； 血球計數(shù)板：上海醫(yī)用光學儀器廠。 驗方法 離、培養(yǎng)、鑒定與凍存 分離與培養(yǎng)：取正常足月新生兒臍帶約 10臍靜脈內腔縱向剪開血管，剝離臍靜脈內膜，將剩余組織切成 5.0 小塊，貼于 含 10%胎牛血清 （ 10養(yǎng)皿底， 放入 37 、 5%養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡每天觀察細胞生長情況 。 3d 后首次換液，以后每 3d 換液 1 次，至細胞長至 80%，按 1： 2 傳代，至第 4 代備用。 鑒定： 取 胞， 無菌 滌 3 次，用 蛋白酶消化 ， 調整細胞 密度為 106 0 6/為每管 0.1 性對照管加入鼠 它管分別加入鼠抗人抗體 溫孵育 30式細胞儀計數(shù) 5000細胞。 凍存：將生長至 80%以上的細胞，吸除培養(yǎng)基，用無菌 洗 3 遍，將 盡，加入 蛋白酶消化液，置于 37 ， 5%的 化約 1出后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞回縮、細胞間隙明顯增大后，立即倒掉胰蛋白酶消化液，然后用加入 含 10%復多次吹打瓶壁細胞，制備成細胞懸液 。將懸液吸出，轉入 151500 轉 /心，去除上 清，加入 600 懸后，將細胞液轉入已提前加好 100 l 二甲基亞砜（ 300 一次性無菌細胞凍存管中。凍存液 1： 3： 6。將凍存管封口標記，放入冰箱， 4 2h， 2h， 8h，最后轉至液氮罐內長期保存。 蘇、培養(yǎng)、傳代與凍存 復蘇、培養(yǎng)與傳代： 將 凍存的 胞 放入 37水浴鍋，快速搖晃至融化，轉入 15心管（內含 打混勻， 1000 轉/心，去上清，轉入 25養(yǎng)瓶，并加入含 10% 州大學碩士研究生學位論文 6 放入 37 ， 5%的 養(yǎng)箱中培養(yǎng) ，隔天換液， 繼續(xù)培養(yǎng)，后 每 3d 換液 1 次 ，細胞生長融合 至 80%，即可傳代。完全棄去原培養(yǎng)液，以無菌 沖洗 3 遍，吸盡 加入 蛋白酶消化液，置于 37 ， 5%的 養(yǎng)箱中 消化約 30出后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞回縮、細胞間隙明顯增大后，立即倒掉胰蛋白酶消化液，然后用加入 含 10% 復多次吹打瓶壁細胞，制備成細胞懸液， 傳代備 用 。 凍存： 將生長至 80%以上的細胞，吸除培養(yǎng)基，用無菌 遍，將 盡，加入 蛋白酶消化液，置于 37 ， 5%的 化約 30出后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞回縮、細胞間隙明顯增大后，立即倒掉胰蛋白酶消化液，然后用加入 含 10%復多次吹打瓶壁細胞，制備成細胞懸液 。將懸液吸出，轉入 151500 轉 /心，去除上清，加入 700 懸后，將細胞液轉入已提前加好 100 200 一次性無菌細胞凍存管中。凍存液 1： 2： 7。將凍存管封口標記，放入冰箱， 42h， 2h， 8h，液氮罐內長期保存。 長曲線 分別 取 90%融合的 備單細胞懸液調整細胞 密 度為 1105 個 /種于 96 孔板 ， 每孔 30 l， 置培養(yǎng)箱培養(yǎng) ， 每 3d 更換培養(yǎng)液。從第 2 天起每隔 24h 隨機取 3 孔細胞 ， 色法測各孔光密度值 ( ) ，連續(xù)測 9 天，以時間為橫坐標， 為縱坐標繪制各細胞的生長曲線。具體操作：測定前每孔加入 液 20 l， 37孵育 4 h，盡量吸掉上清液，每孔加入 150 l 溫振蕩 10 擇 490長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的 ，并求其平均值。以時間為橫坐標、光密度 (D)為縱坐標繪制細胞生長曲線。 細胞計數(shù)方法：終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸除，用無菌 洗 1 次。蛋白酶消化液，置于 37 ， 5%的 養(yǎng)箱中 消化 （ 30 1取出后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn) 細胞回縮、細胞間隙明顯增大后，立即倒掉胰蛋白酶消化液，然后用加入 含 10%復多次吹打瓶壁細胞，制備成細胞懸液 。在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)專用蓋玻片，用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上的計數(shù)板凹槽處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。置于顯微鏡下，計數(shù)四角大方格內的細胞總數(shù)，對于壓線的細胞，只計數(shù)在上線和左線者，對于細胞團按單個細胞計數(shù)。細胞密度 =（ 4 個大格細胞總數(shù) /4） 104 個 /加入適量含 10% 7 調整密度。 培養(yǎng) 應用 6孔塑料細胞培養(yǎng)板，在孔徑 層接種1 105在下層接種 胞 (1 105 立上下雙層細胞共培養(yǎng)體系。實驗分組： (1)空白對照組：其上層只含培養(yǎng)基 )； 其上層只含培養(yǎng)基 ) (2) 實驗組： 采用 37 ， 5 %養(yǎng)液為含 10 % 上述體系培養(yǎng)，觀察 24、 48h，各時間段于倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察活體細胞形態(tài)學改變。 測指標 （ 1）用 測各組的細胞增殖抑制率； （ 2）采用 色法，直觀觀察 殖抑制情況； （ 3）采用流式分析技術檢測各組 亡情況； （ 4） 采用 檢測各實驗組細胞上清液中 蛋白的表達 ； （ 5） 采用熒光實時定量 測各組細胞中 、 （ 6）采用 檢測各組 、 白 表達。 實驗指標檢測具體方法及步驟 測各組的細胞增殖抑制率 第一步：分別將各組培養(yǎng) 24h、 48h 細胞取出，將上層 室內液體吸出， 1500 轉 /心，將上清轉入對應下層培養(yǎng)板內。 第二步：每孔加入 400 5mg/放入 37 ， 5 %養(yǎng)箱內4h。 第三步：棄去培養(yǎng)液，每孔加 l 避光震蕩 10藍色結晶物充分溶解。 第四步：取出 96 孔板，將 6 孔板內液體轉入， 150 l/孔，每 6 孔板設 10個復孔 。 第五步：酶標儀檢測。選擇 490長測定各孔吸光值，以僅加入 檢測儀上比色測定并記錄各孔光吸收值（ A 值）。 第六步：計算細胞生長抑制率 =（ 1 值 /對照組 A 值） 100%。 蘭州大學碩士研究生學位論文 8 色法，直觀觀察 殖抑制情況 第一步：分別取共培養(yǎng) 24h、 48h 后細胞進行處理。將上層 室移除，將培養(yǎng)基吸除，加入多聚甲醛 2定 30 第二步：無菌 洗 2 遍，每次 5 第三步：加入 料 500 l/孔，避 光孵育 6染料吸除，于熒光顯微鏡下觀察。 式分析技術檢測各組 亡情況 第一步：分別于 24、 48h，將 6 孔板內培養(yǎng)基吸除，無菌 洗 3 遍，酶消化，吸除胰酶，加入 分吹打至細胞脫壁。 第二步：轉入 15心管內， 1500 轉 /心，去上清， 加入 300 l 的 1浮細胞 ，轉入上樣管。 第三步： 每管內 加入 5 光，室溫孵育 15 第四步： 上機前 的 5加入 色 5 l。 第五步：上機前 補加 1l。 檢測各實驗組細胞上清液中 蛋白的表達 第一步： 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設 置 標準孔 8 孔，在每孔中 分別 加入標準品稀釋液 100 l，然后再 在 第一孔加入標準品 100 l， 充分 混勻后用槍頭吸出 100 l， 轉 移至第二孔。如此反復 ，作 對倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出 100 l 棄 除 ，使每孔均為 100 l。第八孔為空白對照孔（不加樣品及酶標試劑）。 第二步： 加樣：加樣前將樣品從 冰箱取出， 在室溫 下 平衡 30酶標包被板 的 上樣品待測孔的底部分別加 入 各組樣品 100 l。 第三步： 加酶：每孔加入 酶聯(lián)親和物 50 l，充分混勻，空白對照孔 內 不加。 第四步： 溫育：用保鮮膜封好酶標包被板后，放入 37 溫箱內溫育 約 1h。 第五步： 洗滌： 在 1h 后，倒掉板內 所有 液體，將板內液體 放 在濾紙上 反復扣干，在每孔中 均 加滿洗滌液，靜置后， 將 洗滌液倒去， 再次在 濾紙上完全扣干殘余液體， 反復 清洗 6 次，方法同前 。 第六步： 顯色：每 孔 內 加 入 底物 50 l， 之后 加入底物 50 l，充分混勻，室溫下避光顯色 約 15 第七步： 終止： 在 15，每孔 內 加 入 終止液 50 l，充分混勻 。 第八步： 比色：加入終止液 后 30 內，使用酶標儀 ， 在 450長 檢測 各孔的 （以空白對照孔調零）。 蘭州大學碩士研究生學位論文 9 第九步：根據(jù)標準品檢測結果 繪制標準曲線， 再根據(jù)樣品 算出各指標具體的 濃度 。 用熒光實時定量 測各實驗組的細胞中 、 表達 總 提?。?第一步：將培養(yǎng) 24h、 48h 細胞取出，吸除培養(yǎng)液，用無菌 洗 1 次，6 孔板每孔內加入 平放置片刻，充分吹打使 細胞完全脫落，轉入離心管內，再次反復吹打至無沉淀，室溫下靜置約5 第二步：放入離心機 12000 轉 /心，將上清轉至 心管內。 第三步：每管內加入氯仿 200 l，雙手劇烈震蕩 20s，至充分乳化。室溫下靜置 5 第四步：再次放入離心機 12000 轉 /心，小心取出離心管（可見已分層），將上清轉移至新的離心管內（切忌吸到白色部分）。加入等體積的異丙醇，上下顛倒，充分混勻。室溫下靜置 10 第五步：放入離心機 12000 轉 /心，取出后可見沉淀 。小心吸去上清，沿壁緩慢加入 75%乙醇 1觸及沉淀），輕輕的上下顛倒洗滌管壁。 第六步：放入離心機 12000 轉 /心，取出后小心吸去上清。室溫下放置干燥 5 第七步：每管內加入 30 l 以溶解沉淀，輕輕混勻后，放入 箱保存。 度及濃度測定 第一步： 純度 測定 ：吸出 提前制備好的 解液 2 l，加 入 高溫消毒過的 98 l， 50 倍稀釋后備用，將微量比色杯先用 沖洗干凈，并在杯中加入 ，在紫外分光光度計上測定波長260 280 品的 ?？瞻坠?內 為不含 。 純度用 比值 R 值反映， 反映 的是 的蛋白質等有機物的污染程度，純度較好的 值 應該 在 間，當 R 值 ， 則 說明 經(jīng)被水解成 了 單核苷酸。 本實驗所有提取的總 R 值均在 蘭州大學碩士研究生學位論文 10 第二步： 計算 度： 度 =釋倍數(shù) g/ l。 逆轉錄反應 反應液配置見表 1 表 1 逆轉錄反應液配置 試劑 使用量 5 l l 0 M) l 00 M) l l l 逆轉錄反應條件：使用 轉錄試劑盒， 反應條件為 37 15 85 5 s， 反應體系為 10 l 。 引物設計 根據(jù)實驗要求，在 詢所需 基因相應的 列 ， 使用物設計軟件 進行 引物設計，由 生工生物工程（上海）有限公司 合成 。引物序列 見表 2。 表 2 熒光實時定量 物序列 基因 引物序列 (53) F: : : : : : 光實時定量 應 按照 司 )的使用 說明進行實驗 操作 。 反應液配制（在冰上進行）見表 3 表 3 增反應液配置 試劑 使用量 蘭州大學碩士研究生學位論文 11 x (2 ) 5 l 10 M) l 10 M) l 板 1 l 菌蒸餾水 ) l 0 l 應條件：采用兩步法擴增 ：預變性： 95 30 s， 1 個循環(huán) ； 應：95 變性 5 s， 60 30s， 40 個循環(huán) 反應。反應結束后 確認 擴增曲線和融解 曲線， 進行 量時制作標準曲線。 利用 為內參基因，應用最常用的簡便計算 對數(shù)據(jù)結果進行相對定量分析，即基因表達差異（ =2 的基因 參基因） 的基因 參基因） 檢測各組 、 白 表達 蛋白提取（在冰上進行） 第一步：將分別培養(yǎng) 24h、 48h 的細胞取出，移除上層 孔內培養(yǎng)基吸凈，無菌 洗 1 次。 第二步：每孔內加入蛋白裂解液 150 l，用細胞刮刀縱向刮取，轉移入無菌離心管內。 第三步：用 1管吹吸 20。 第四步： 12000 轉 /心。將上 清轉移至新的離心管，標記， 存?zhèn)溆谩?蛋白定量 使用 白濃度測定試劑盒進行蛋白定量 第一步：配制工作液：根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按 1 體積 劑加 50 體積 劑（ 1： 50）配制成 作液，充分混勻（混合時可能會出現(xiàn)渾濁，但充分混勻后渾濁會消失）。 作液在 24h 內穩(wěn)定。 第二步：稀釋標準品：取 準品 10 l 用無菌 釋至 100 l，使其終濃度為 標準品按 0， 2， 4， 6， 8， 12， 16， 20l 分別加入到 96 孔板的蛋白標準品孔內，并加如 足至 20 l。 第三步：將樣品作適當?shù)南♂專?5， 10， 20 倍稀釋），稀釋后加 20 l 到 96孔板的樣品孔中。 蘭州大學碩士研究生學位論文 12 第四步：各孔內分別加入 作液 200 l， 37下放置 15酶標儀在波長 562進行測定，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。 樣品處理 第一步：根據(jù)蛋白濃度計算出上樣量。 第二步：計算出加入 1： 3）的量， 100 10水煮樣。 一步：上樣 第二步： 泳： 100 30h。 第三步：膜平衡：用于轉移的膜先在甲醇中浸 泡 30s，然后轉移到轉膜緩沖液中冰浴下平衡 30 第四步：膠平衡： 束后，把膠取出，置入轉膜緩沖液中平衡30時將濾紙和海綿也放入轉膜緩沖液中冰浴下平衡30 第五步： 組裝電轉裝置：海綿 海綿， 100h（轉膜緩沖液需 4保存，電轉時冰?。?第六步：封閉：把膜放入專用塑料盒中，加入含 5%脫脂奶粉的 在 37搖床中封閉 2h。 第七步：一抗雜交：封閉結束后，用 洗 1 次，加入含 5%脫脂奶粉的 入所需檢測相應抗體（ 8 37孵育過夜。 第八步：洗脫：用 洗 3 次，每次 10床室溫）。 第九步：二抗雜交：加入含 5%脫脂奶粉的 入二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體） 2 l， 37孵育 2h。 第十步：洗脫：用 洗 3 次，每次 10床室溫）。 第十一步： 曝光：加顯色液和發(fā)光液（超敏發(fā)光液）各 100 l，上機曝光。 計學處理 采用 件，計 數(shù)資料比較采取卡方檢驗，計量資料比較采用 t 檢驗， 以 P 差異有顯著性統(tǒng)計學意義。 蘭州大學碩士研究生學位論文 13 結 果 培養(yǎng)與鑒定 相差倒置顯微鏡下 觀察， 1織塊部分貼壁 ， 6外觀呈紡錘形或多角形，可見細胞核。 10多， 已有成片聚集 ， 聚集處呈火山噴發(fā)狀。細胞多為長梭形或扁平形的成纖維樣細胞 ， 核仁明顯。180%， 細胞密度較低時成扁平單層細胞 ， 細胞密度較高時趨于融合細胞變細長類似成纖維細胞呈平行或旋渦狀生長 ，如圖 1。 此時消化、傳代去除組織塊 傳代后細胞生長能力明顯增強 ， 至 貼壁速度增快，生長迅速，細胞排列整齊，分布均勻，生長一致， 隔天細胞即需傳代。 經(jīng)流式細胞儀檢測， 表達造血干細胞所標記的 表達內皮細胞標記的 圖 1 0%融合， 細胞變細長類似成纖維細胞呈平行或旋渦狀生長 （ 10） 培養(yǎng) 相差倒置顯微鏡下可見初 復蘇 的 圓球狀、細胞質透亮且內含豐富黑色折光的脂滴顆粒， 體積小于肝細胞，大于庫普弗細胞。 2，細胞開始貼壁生長，呈扁圓或梭形，細胞質內脂滴明顯，部分細胞已開始向外伸展。 24大片狀伸出偽足 。 2d 后，細胞質中的脂滴逐漸減少甚至消失，細胞呈片狀伸展，偽足很長，胞內可見細絲狀結構，可見新增殖分裂的細胞，見圖 2。 蘭州大學碩士研究生學位論文 14 圖 2 0%融合， 細胞呈片狀伸展，偽足很長，胞內可見細絲狀結構，可見新增殖分裂的細胞 （ 10） 長曲線 胞一般 8 天左右能達到 80%以上融合。細胞傳代后 1 2 天為滯留期， 3 天后達對數(shù)生長期，第 5 天進入平臺期。 明顯的增殖遲滯期 0 2 天， 3 天后達到對數(shù)生長期， 而且在第 7 天之后出現(xiàn)平臺期 。 外培養(yǎng)生長曲線，見圖 3。 490 3 4 5 6 7 8 9生長時間（天） 測各組的細胞增殖抑制率 本實驗利用前述公式計算細胞增殖抑制率。與 相比 ， 培養(yǎng) 24 h， ， n = 10， p ， 隨著培養(yǎng)時間延長 ， 州大學碩士研究生學位論文 15 增殖活性受抑制更明顯 (48 ， n =10， p 。 相差倒置顯微鏡下 表 4 共培養(yǎng)后 殖抑制率（ % n=10） 分組 24h 48h 值 pp色法，直觀觀察 亡情況 與對照組相比共培養(yǎng)組可見較多凋亡細胞，且 48h 多于 24h。（凋亡細胞染色質固縮，細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染）見圖 4444 圖 424蘭州大學碩士研究生學位論文 16 圖 424圖 448圖 448式分析技術檢測各組 殖抑制情況 采用流式細胞儀 I 雙染法檢測 培養(yǎng) 24h 及 48h 后 凋亡情況如圖 5555 蘭州大學碩士研究生學位論文 17 圖 5共培養(yǎng)組 24蘭州大學碩士研究生學位論文 18 圖 5單獨 4表 5式分析 24h 單獨 養(yǎng)組與共培養(yǎng)組 分組 細胞數(shù) 16192 不同狀態(tài)細胞數(shù)及構成（ %） 死亡細胞 晚期凋亡 正常細胞 早期凋亡 培養(yǎng) 8029 8163 4 （ 2 （ 21（ 28（ 7819（ 7884（ 185（ 249（ 如表 5示：經(jīng)卡方檢驗顯示共培養(yǎng)組凋亡細胞多于單獨 養(yǎng)組。 2=p=p 異有統(tǒng)計學意義。 圖 5共培養(yǎng)組 48蘭州大學碩士研究生學位論文 19 圖 5單獨 8表 5式分析 48h 單獨 養(yǎng)組與共培養(yǎng)組 分組 細胞數(shù) 16519 不同狀態(tài)細胞數(shù)及構成（ %） 死亡細胞 晚期凋亡 正常細胞 早期凋亡 培養(yǎng) 8451 8068 2（ 7（ 10（ 33（ 8359（ 7893（ 80（ 135（ 如表 5卡方檢驗顯示共培養(yǎng)組凋亡細胞多于單獨 2=p 異有統(tǒng)計學意義。 用 檢測各實驗組細胞上清液中 蛋白 濃度 表 6 測各實驗組 24h、 48h 上清液中 濃度（ n=3） 分組 24h 48h 值 p=p=表 6 所示 ： 共培養(yǎng)組 與 養(yǎng)組 24h 比較， p共培養(yǎng)組 與 養(yǎng)組 48h 比較， p獨 養(yǎng)組 濃度過低，低于酶聯(lián)免疫試劑盒最低檢測值，故測不出。 用熒光實時定量 測各實驗組的細胞中 、 表達 蘭州大學碩士研究生學位論文 20 圖 6 熒光實時定量 組細胞中 、 表達 ?？梢妴为?于共培養(yǎng)組， p獨 養(yǎng)組 于共培養(yǎng)組， p=獨 養(yǎng)組 于共培養(yǎng)組， p=用 檢 對各組 、 白 表達 2444848 圖 7 各組 24、 48、 白 的表達 表 7 檢對各組 、 白 表達（ n=3） 組別 24h 48h 州大學碩士研究生學位論文 21 共培養(yǎng)組 t 值 p 值 表 7 所示： 、 白表達， 24h、 48h 共培養(yǎng)組與 比較，p 均 異有統(tǒng)計學意義。 蘭州大學碩士研究生學位論文 22 討 論 肝硬化是 我國 常見的慢性、彌漫性、進行性肝病，由一種或幾種病因反復或長期作用導致的肝 臟彌漫性損害，肝細胞變性、壞死、再生和再生結節(jié)形成 是 其基本病理 的 改變， 同時 伴有結締組織增生和纖維隔形成，最終 引起 肝小葉結構破壞 、 假小葉形成 10。肝功能減退和門靜脈高壓引起的兩大群表現(xiàn) 是該疾病 失代償期的主要臨床表現(xiàn)。 肝硬化是各種慢性肝臟疾病的終末期，是一種嚴重威脅人類健康的疾病。 肝纖維化是肝硬化的早期狀態(tài)， 是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和 所 必經(jīng) 的 途徑 11。 大量研究表明，肝纖維化是可以逆轉的 12 肝纖維化的形成是一個緩慢而復雜的過程，是 繼發(fā)于 各種因素引起的反復的 肝臟炎癥損傷或 損傷 后 修復的結果， 是肝臟纖維結締組織過度沉積的結果， 其實質是 變 。 身并非單純 的 作為一種組織結構 而 存在，它具有廣泛的生理功能， 是 對 于 細胞、組織、器官的形態(tài)、生長、分化 及 代謝等結構 、 功能有重要影響的生物大分子 15。肝纖維化 發(fā)生 時， 改變涉及量、質兩方面。量的改變 主要 表現(xiàn)為肝內過量膠原 的 形成以及沉著， 的改變表現(xiàn)為 局部 的 重建或重 新 分布， 期主要沉積在 的 內皮下 ， 隨后 在 內皮下形成連續(xù)的基底膜 ， 內皮窗孔消失，即肝竇毛細血管化 16。 于 隙內， 緊貼著肝竇內皮細胞（ 肝細胞 ， 主要來源， 肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時 被 激活并轉化為 達 合成 種致纖維化因素均把 激活后的 泌 如 各種促纖維化 的 因子，促進 了 肝纖維化的形成 17 同時 功能受 到 免疫