密級 論文編號 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 苜草素對小鼠巨噬細(xì)胞 泌 的影響及其機(jī)理研究 O、 O、 目 錄 英文縮略表 . I 摘 要 . . 言 . 一章 緒 論 . 1 1 巨噬細(xì)胞分泌活性物質(zhì)的功能與調(diào)控 . 1 . 1 . 3 . 4 2多糖對巨噬細(xì)胞功能影響 及機(jī)制 . 6 糖對巨噬細(xì)胞活性的影響 . 6 糖增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性的機(jī)理 . 8 3 黃酮類化合物對巨噬細(xì)胞功能的影響及機(jī)制 . 10 . 10 . 11 酮類化合物對巨噬細(xì)胞分泌功能影響的機(jī)理研究 . 12 4皂苷對巨噬細(xì)胞功 能的影響及機(jī)制 . 14 . 14 苷對巨噬細(xì)胞分泌功能的影響及機(jī)理研究 . 14 5 絲裂素活化蛋白激酶的作用 . 16 38 . 16 38 . 17 38 . 18 6 立題依據(jù)及總體構(gòu)思 . 19 第二章 試驗(yàn)研究 . 21 試驗(yàn)一 苜草素對 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活 性、細(xì)胞代謝活性的影響 . 21 試驗(yàn)二 苜草素對 小鼠巨噬細(xì)胞 噬活性和 泌量的影響 . 24 試驗(yàn)三 苜草素對巨噬細(xì)胞 達(dá)量的影響 . 32 試驗(yàn)四 苜草素誘導(dǎo) 泌和表達(dá)中的作用 . 45 第三章 主要結(jié)論與有待進(jìn)一步研究的問題 . 48 1 本論文的主要結(jié)論 . 48 2 本研究的創(chuàng)新點(diǎn) . 48 3 有待進(jìn)一步研究的問題 . 48 參考文獻(xiàn) . 49 附錄 . 60 致 謝 . 64 作 者 簡 歷 . 65 I 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 氧化氮 導(dǎo)型一氧化氮合成酶 介素 6 瘤壞死因子 多糖 of 4 白細(xì)胞分化抗原 補(bǔ)體受體 3 細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶 核因子 B B, 核因子 制劑 蛋白激酶 C 蛋白激酶 A 裂原活化蛋白激酶 基末端激酶 胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 絲裂原活化蛋白激酶 激酶 擾素 介素 達(dá)核因子 化生長因子 瘤壞死因子受體相關(guān)因子 單核細(xì)胞趨化因子 1 2 環(huán)氧合酶 要 巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成份 ,具有吞噬、殺傷、遞呈抗原、分泌生物活性物質(zhì)、調(diào)控局部組織微環(huán)境以及抑制腫瘤等多種功能 ,構(gòu)成了機(jī)體非特異防御的主要基礎(chǔ)。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)苜草素對肉仔雞的免疫機(jī)能具有增強(qiáng)作用，對小鼠外周淋巴細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。為了 進(jìn)一步研究揭示苜草素對動物免疫系統(tǒng)的作用效果及其機(jī)理，以 c 小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，通過活體上觀察、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞因子及其 達(dá)量檢測、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多層次和系統(tǒng)的試驗(yàn)分析，研究了苜草素對巨噬細(xì)胞功能的影響及其機(jī)理。 試驗(yàn)一 苜草素對 c 小鼠 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性、代謝活性的影響 為了檢測苜草素在體內(nèi)對小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響，本試驗(yàn)以 50 只雄性， 6齡 機(jī)分為四組：空白組， 300mg/d、 500 mg/d、 1000 mg/組 10只。每天灌胃給藥一次 ,空白對照組用等體積的 理鹽水代替 , 連續(xù) 14d。于第 14d 處死，制備腹腔巨噬細(xì)胞，測定苜草素對其吞噬活性、代謝活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著苜草素劑量的增加，巨噬細(xì)胞的吞噬活性逐漸增加，并在 1000 mg/到顯著性差異（ P但是對巨噬細(xì)胞的代謝活性沒有顯著影響。 試驗(yàn)二 苜草素對巨噬細(xì)胞 噬活性和 泌量的影響 為確定苜草素對巨噬細(xì)胞吞噬活性和 泌量的影響，以不同濃度（ 苜草素處理 噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 隨著苜草素濃度的增加 吞噬活性也逐漸增加趨勢，在 開始呈現(xiàn)顯著性差異 （ P，在1mg/巨噬細(xì)胞的吞噬能力達(dá)到最高達(dá)到最大值，這與活體觀察結(jié)果相一致。對于 著苜草素濃度的增加，其逐漸降低了 導(dǎo)的 分泌。與 理組相比，P在 1mg/且 苜草素逐漸抑制了 相比，從 P,并逐漸降低，在 1時抑制作用達(dá)到最大程度。苜草素增加了 隨著苜草素劑量的增加， 分泌量逐漸升高， 與空白組相比，從 P,在 1mg/ 試驗(yàn)三 苜草素對巨噬細(xì)胞 達(dá)量的影響 為進(jìn)一步確定苜草素對 O、 先確定了 以 不同濃度的苜草素 ( .0 mg/和脂多糖（ 10 g/理 后檢測細(xì)胞因子 果發(fā)現(xiàn) 隨著苜草素劑量的增加， 表達(dá)量逐漸下降，這與前期檢測 分泌減少相吻合。因此可以推測，苜草素降低 表達(dá)。苜草素對 其相反， 其顯著增加了巨噬細(xì)胞 與前期檢測 綜上所述， 苜草素通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞 因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)了 分泌量。 驗(yàn)四 苜草素通過 控 表達(dá)和分泌 為了研究 否在苜草素對 調(diào)控中起到作用，首先確定了 苜草素刺激巨噬細(xì)胞的最佳濃度和最佳時間，然后 以 1、 5、 10、 20 g/ 制劑以抑制 后 在最適的苜草素濃度和最適時間下再處理巨噬細(xì)胞，然后檢測 苜草素處理的巨噬細(xì)胞 們發(fā)現(xiàn) 達(dá)量的 上升。根據(jù)此結(jié)果可以確定，苜草素是通過 關(guān)鍵詞： 苜草素 巨噬細(xì)胞 of an in in In we in of To on in on in in To on in 50 c 0 00mg/d,500 mg/d,1000 mg/d, in Pin no on on O, In to on O, in a in a of .4 P .6 .0 mg/P In NO PS in a to PP in in O, in o to O, in on 10g/ml）of we V PS O, at of in an in in To if in we ,5,10,20 g/ml)of at It is in by c 言 苜蓿（ ）英文名 屬豆科、多年生草本植物 種類繁多，分布極廣 ，全世界共有 60多種，我國有紫花 苜蓿 、黃花 苜蓿 、南 苜蓿 、天藍(lán) 苜蓿 、褐斑 苜蓿 及矩鐮莢 苜蓿 等種。其中紫花苜蓿，是人類迄今發(fā)現(xiàn)對人體健康營養(yǎng)最全面的草本植物之一， 最有栽培價值，其他大多數(shù)為野生類型。紫 花苜蓿 經(jīng)長期栽培，已適應(yīng)一定的生態(tài)環(huán)境，形成了優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗病抗寒耐旱等品種或地方品種。 （耿華珠等， 1995） 紫花苜蓿最早是阿拉伯人發(fā)現(xiàn)的可食用健身的蔬菜 ，取名為“苜?！?含意為食物之父，已有 3000 余年的種植、食用、飼用的悠久歷史。苜蓿具有免疫調(diào)節(jié)，降血糖、降血脂、抗炎、抗疲勞、抗衰老等功效。大量試驗(yàn)證明，苜蓿能防止試驗(yàn)動物的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化，也能加速試驗(yàn)動物的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化斑塊的消退。（何 云等， 2005）苜蓿在我國畜牧業(yè)生產(chǎn)中有很高的利用價值，主要表現(xiàn)為：促進(jìn)動物生長發(fā)育，提高免疫機(jī)能；改善胴體品質(zhì)，提高瘦肉率；調(diào)節(jié)脂肪代謝，可降低血清中血脂含量；對內(nèi)分泌激素的分泌產(chǎn)生影響。 關(guān)于苜蓿在動物生長、脂肪代謝和免疫調(diào)節(jié)方面的積極作用 ，已有不少的相關(guān)研究報道。然而人們很少對苜蓿中有效成分進(jìn)行深入研究。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所自 1996 年開始，針對苜蓿中有利于動物健康的有效成分進(jìn)行深入研究。經(jīng)過多年研究成功研發(fā)出了“苜草素”（ 其以多糖、黃酮、皂苷為主要活性成分。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過動物飼養(yǎng)試驗(yàn)證明，苜草素可顯著抑制肉仔雞腹脂沉積，并對其機(jī)理進(jìn)行了深入研究。 同時我們也發(fā)現(xiàn)苜草素可顯著提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和新城疫病毒抗體滴度。這說明苜草素具有免疫調(diào)節(jié)作用。 巨噬細(xì)胞具有吞噬、殺傷、遞呈抗原、分泌生物活性物質(zhì)、調(diào)控局部組織微環(huán)境以 及抑制腫瘤等多種免疫功能，是機(jī)體非特異免疫的重要組成部分。為了進(jìn)一步了解苜草素是如何調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，為 其在飼料添加劑和動物營養(yǎng)代謝調(diào)控中的科學(xué)使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，我們選擇了巨噬細(xì)胞作為研究對象，觀察苜草素對巨噬細(xì)胞功能的影響并進(jìn)行了深入的機(jī)理研究。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 巨噬細(xì)胞分泌活性物質(zhì)的功能與調(diào)控 功能與調(diào)控 生物體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，是一種短期的生物活性分子，在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和 心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。 族是 們可以催化 O。 別為神經(jīng)元型 (內(nèi)皮型 (誘導(dǎo)型 (前兩種為結(jié)構(gòu)型 表達(dá)依賴細(xì)胞內(nèi)鈣離子激活，而 在通常情況下不表達(dá)。但在內(nèi)毒素、 , 噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、組織中的免疫細(xì)胞和胰島細(xì)胞等通過啟動基因轉(zhuǎn)錄合成 達(dá)即具有催化活性，因而體內(nèi)高于生理濃度的 常是 穩(wěn)定，半衰期很短 (3可迅速和水、氧及機(jī)體中的超氧陰離子反應(yīng)，生成硝酸鹽和亞硝酸鹽。 可以協(xié)助機(jī)體殺傷受感染組織和腫瘤細(xì)胞，但是 在循環(huán)性休克和炎癥的病理過程中均可見到 大量產(chǎn)生，過量釋放的 直接作用于血管平滑肌，使其麻痹性舒張，對血管活性藥物出現(xiàn)低反應(yīng)性，造成難治性低血壓。另有報道認(rèn)為 性介質(zhì)。 僅作為第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)在細(xì)胞一細(xì)胞間信息傳遞中起著重要的調(diào)節(jié)作用，也可以介導(dǎo)免疫效應(yīng)和炎癥。 O 進(jìn)而引起血管擴(kuò)張充血和水腫，導(dǎo)致低血壓，抑制U 血小板聚集，還可以促進(jìn)其它炎癥介質(zhì)如 感染性休克病理生理過程中起十分關(guān)鍵的作用。 表達(dá)所產(chǎn)生的過量 全身感染循環(huán)衰竭密切相關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)顯示，給大鼠腹腔注射內(nèi)毒素后，其體內(nèi) 產(chǎn)量是對照組的 10 倍。臨床研究亦表明，感染性休克病人血漿中 代謝產(chǎn)物一硝酸鹽和亞硝酸鹽的濃 度顯著升高。另一方面，抑制 活性可顯著改善感染性休克動物及病人血管低反應(yīng)性，糾正低血壓。而且，將小鼠 毒素即不能引起嚴(yán)重低血壓。 隨著小鼠 們發(fā)現(xiàn) 管， 1992） 。將 端（包括啟動子）與報告基因融合證明 ， 1993； . J， 1993; W,1993） 。人 端 16結(jié)構(gòu)和調(diào)控方式是很復(fù)雜的 (E ,1996)。至今已發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，具有控制作用的順式作用元件已經(jīng)被鑒定了，但是其中涉及的轉(zhuǎn)錄因子和功能元件還不是很清楚。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 小鼠 在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)參與了 后，在大鼠和小鼠的肺泡巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞血管平滑肌細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)了 的調(diào)控作用。其中 c 個復(fù)合物中還有很多轉(zhuǎn)錄因子沒有被鑒定。 (等， 1994； 1996) 至于 擾素調(diào)節(jié)因子 1（ 失的小鼠體內(nèi)不能 等， 1994） 。通過突變、凝膠阻抑、血清學(xué)和 等 1994） 。 至今在 4個轉(zhuǎn) 錄因子的結(jié)合位點(diǎn)?，F(xiàn)在的研究主要集中在位于227 209的低氧效應(yīng)元件（ 其主要對 皮考啉酸 和缺氧進(jìn)行響應(yīng)（ 等， 1995） 。此外，在 反應(yīng)元件被定位在啟動子的 333 48區(qū)域。（ ,等， 1996） 病理水平的糖皮質(zhì)激素可以抑制 在已經(jīng)報道了多種機(jī)制，其中涉及到轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的影響。 4可以延遲 成劑量關(guān)系。但是巨噬細(xì)胞失活因子、 巨噬細(xì)胞刺激蛋白 1以及 何調(diào)控 等， 1996； 等，1994； 1994; 等， 1991； 1992； 等， 1995. H 等， 1994； 1993） 。 圖 1 在小鼠巨噬細(xì)胞中，已知的最有效的 缺陷的小鼠中 且低劑量 可以抑制的 體外的研究表明， 降低了 遲了 反，在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中 抑制了 等， 1994;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 等 ,1996 ； 1996； A 等， 1994） 。 巨噬細(xì)胞中，已經(jīng)證明了血紅素的調(diào)控作用。 因血紅素的去除導(dǎo)致了 A 等， 1996； . 等， 1994） 。 在小鼠原代巨噬細(xì)胞中 是這種修飾劑量關(guān)系和功能的意義還不是很清楚。與 蔻?；?和 棕櫚?；?。在小鼠巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大約 50的 電鏡下 觀察，這些膜結(jié)構(gòu)不同于溶酶體和過氧化酶體。這種胞質(zhì)體和小泡之間的區(qū)分很可能是因?yàn)楣δ苤g不同，但是這種假設(shè)還需進(jìn)一步證明（ 等， 1995； 。 功能與調(diào)控 生物學(xué)功能 一種單核因子，主要是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。有非常廣泛的生物學(xué)作用（ 等， 2003） 。它可活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，提高其殺傷活性；可通過上調(diào)巨噬細(xì)胞 高其抗原遞呈能力；還可提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)超 氧陰離子產(chǎn)生，增強(qiáng) 激細(xì)胞脫顆粒和分泌髓過氧化物酶；活化 揮細(xì)胞毒作用（ 等， 1989； 等， 1988； 等， 1992）。 同時， 可以對成脂相關(guān)基因具有抑制作用，抑制脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)脂肪分解（ 等， 2004） 。 調(diào)節(jié)脂肪代謝中具有很重要的功能，在培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中， 低了脂蛋白脂酶活性，抑制了脂肪酸的合成過程，并且刺激脂肪分解的增加。此外 在小鼠體內(nèi)注射 增加了瘦素的含量，而瘦素通過作用于下丘腦攝食中樞減少攝食，增加能量消耗，減少脂肪沉積。 方面通過降低 脂肪組織中脂蛋白脂酶的活性而降低甘油三脂類的清除 率，另一方面增加脂肪脂肪酸的從頭合成，造成低密度脂蛋白的增加。 圖 1癥因子和外界應(yīng)激對脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪代謝和分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的影響 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 中包括不同革蘭式陰性細(xì)菌來源的脂多糖、 有趣的是，不同細(xì)菌來源的脂多糖制劑可以誘導(dǎo) 如 E. 誘導(dǎo)持續(xù)高水平的 P. 關(guān)于 要是在體外純化的巨噬細(xì)胞中進(jìn)行（ 等 , 2002 ;等 ,2000; 等 2003） 。在 表達(dá)研究中，尤其在體外，調(diào)控在哺乳動物和魚類十分相似。在體外，單核 /巨噬細(xì)胞受刺激 后 小時到 12小時之間。姜勇等研究 表明 成的重要機(jī)制。 激單核細(xì)胞顯著增加 在 激和 外， 異性抑制劑 導(dǎo)的 些結(jié)果表明 而基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是 姜勇等， 1999； 1992)。 很多研究表明 的特異性抑制以抑制 表達(dá)，說明 參與了 錄水平的調(diào)控（ 2003） 。 轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 此外， 認(rèn)為 成調(diào)節(jié)的主要機(jī)制是在轉(zhuǎn)錄后水平。 等， 2002）。這段在 3 間的相互作用來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。這種結(jié)合會導(dǎo)致 （ 等，1990 2002） 。因此， 3 哺乳動物的體外研究中， 錄本的半衰期在 40分鐘左右(等， 2003)。還有研究表明 ,短暫的氫化可的松（ 100處理巨噬細(xì)胞可抑制多種促炎因子基因的表達(dá)其中就包括 2003）。 究表明，無論是 氫化可的松預(yù)處理還是氫化可的松與 可抑制 此，氫化可的松對促炎因子表達(dá)的抑制作用是通過皮質(zhì)醇糖皮質(zhì)激素受體復(fù)合物與啟動子區(qū)的固醇反應(yīng)元件結(jié)合或是抑制 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。 功能與調(diào)控 生物學(xué)功能 一種多效性細(xì)胞因子，多種淋巴樣和某些非淋巴樣細(xì)胞均可產(chǎn)生 要由單核 激單核細(xì)胞產(chǎn)生 些單核巨噬細(xì)胞系如 可分泌 機(jī)體發(fā)生炎癥時，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞時最早產(chǎn)生 反應(yīng)細(xì)胞，使局部及全身平 升高。 促進(jìn)細(xì)胞分化。 進(jìn) B 細(xì)胞分化， 分泌和再次免疫應(yīng)答；促進(jìn) 化，協(xié)同 強(qiáng) 穿孔素基因的表達(dá)，并增加 T 細(xì)胞 生和 達(dá)；可以刺激 T 細(xì)胞增殖、活化與存活（ ， 1999； ， 2000）而且可以調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞的功能與存活 ( 等 2000)。主要表現(xiàn)在 明顯刺激抗原特異性細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 增殖并抑制童貞 T 細(xì)胞的凋亡 (000); 因敲除小鼠不能有效促發(fā)特異性 T 細(xì)胞反應(yīng) ;促樹突狀細(xì)胞自分泌或旁分泌 誘導(dǎo)抗自身抗原的免疫反應(yīng)（ 等， 2001）。誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤 胞的分化，誘導(dǎo)垂體產(chǎn)生 同 導(dǎo)干細(xì)胞分化和巨核細(xì)胞成熟，明顯促進(jìn)小鼠骨髓移植后免疫功能的重建；促進(jìn) 胞的分化和殺傷活性。 制單核細(xì)胞 產(chǎn)生，促進(jìn) 分泌，促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)反應(yīng)。 節(jié)腫瘤細(xì)胞生長和分化。 制小鼠 樣白血病細(xì)胞系的生長，促進(jìn)其成熟和分化；抑制黑素 瘤細(xì)胞系 腺癌細(xì)胞生長。使 胞生長停留在 1期，其機(jī)制可能與 響參與細(xì)胞周期調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的有關(guān)。 在炎癥反應(yīng)時 ,為肝細(xì)胞刺激因子 ,誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生急性反應(yīng)蛋白 ,對宿主自身破壞性炎癥起增強(qiáng)作用 （ 張青 等， 2004） 。在多項(xiàng)感染性疾病研究中說明 ,血清 平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān) , 用于評價全身炎癥反應(yīng)的程度 ,可作為監(jiān)測炎癥療效的指標(biāo)。 也認(rèn)為檢測血清中 細(xì)菌性肺炎具有診斷性意義 （ 等， 1995） 。 近期的臨床研究 也發(fā)現(xiàn)某些自身免疫性疾病 ,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (糖尿病部分患者存在 表達(dá)。 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)調(diào)控 盡管目前 調(diào)控表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等已進(jìn)行了較為深入的研究 ,但主要局限于 B 細(xì)胞或 等， 2003）而對于目前已知的抗原遞呈細(xì)胞的 動子的功能、調(diào)控研究較少。目前已知人的 動子 區(qū)有 3 個起陽性調(diào)控作用的 件 ,它們分別