密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 山羊瘤胃和草魚腸道微生物分子生態(tài)研究 及 2 I 摘 要 動物胃 腸道存在著大量的微生物群落 ， 構(gòu)成了動物消化道微生物區(qū)系 ， 這些微生物群落是動物長期進化的結(jié)果 ， 它們和機體的免疫功能、營養(yǎng)需求等都有著密切的關(guān)系。 微生物生態(tài)的監(jiān)測及其群落多樣性分析是微生物生態(tài)學研究所采用的重要技術(shù)手段和內(nèi)容?；诤怂嵝蛄蟹治龅默F(xiàn)代分子生物學技術(shù)可以用來檢測不可培養(yǎng)微生物的種類 ， 完善微生物的分類系統(tǒng) ，從而更真實的反映環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)。植食性動物胃腸道存在大量可降解纖維素和半纖維素的微生物，分泌并應(yīng)用大量纖維素降解酶類。因此，對于植食性動物胃腸道微生物的分子生態(tài)、纖維素酶類多樣性及功能研究在理 論研究和生產(chǎn)實踐中具有重要的意義。 本研究應(yīng)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)研究動物胃腸道微生物分子生態(tài)。利用 16S 8S 因的變性梯度凝膠電泳技術(shù)對三種山羊（波爾山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、四川南江黃羊）瘤胃細菌以及原蟲的 優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)進行了比較分析。研究結(jié)果顯示 譜中條帶數(shù)目少于 16S 譜，并且條帶分離效果明顯，更有利于分析瘤胃細菌群落組成。 種山羊瘤胃細菌均具有一定的相似性，種內(nèi)個體間相似性明顯高于種間相似性，這說明 宿主品種是影響瘤胃細菌 種群構(gòu)成的一個重要因素 。而原蟲種內(nèi)相似性并不高于種間相似性。 利用同樣方法對草魚腸道不同區(qū)段 優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)進行了比較分析。研究結(jié)果表明消化道存在著豐富多樣的細菌群落，對 紋圖譜聚類分析表明菌群組成相似性高于 77%。其中中腸和后腸的細菌多樣性高于前腸，這可能與攝食餌料在消化道推移有關(guān)。 另外，以飼喂單一牧草的草魚腸道為研究對象，篩選到 具有不同纖維素酶活性的菌株 90多株。然后根據(jù)菌落形態(tài)和水解圈差異結(jié)合 16S 終分離到 15株具有不同纖維素水解能力的細菌菌株?；?16S 析發(fā)現(xiàn)，分離菌株分別屬于 希瓦氏菌屬（ 氣單胞菌屬（ 芽孢桿菌屬（ 沙雷氏菌屬（ 克雷伯氏菌屬（ 變形桿菌屬（ 腸桿菌屬（ 檸檬酸桿菌屬（ 進一步 建立了一種快速篩選和評價屬于糖基水解酶家族 1的 碼新基因的方法。纖維素降解領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。 通過對發(fā) 表酶氨基酸序列的同源比較，設(shè)計了一對簡并引物，利用同源克隆技術(shù)，在 15株細菌中克隆得到 11條編碼 相互之間氨基酸相似性在 50%到 98%之間。 實驗結(jié)果 證實了這種快速篩選基因方法的有效性。 通過基因組文庫篩選，從 芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬和變形桿菌屬中分別 獲得了 三個 別命名為 這 三 個基因同已 注冊 的 葡萄糖苷 酶基因序列的 最高 相似性分別為 88%、 72%和 82%。 它們與已報道的進行過功能驗證的來源于 基酸相似性最高，分別為 說明它們是新的 關(guān)鍵詞： 胃腸道微生物，分子生態(tài)，變性梯度凝膠電泳， 基因克隆 he of is by of GI a on in on 6S of a to be of a of of of a of by in of on of in of as as of at in of 6S as a of of (CR 6S of NA 8S to of to of of to be In in no of in 6S in of 7%. in in to is a to of a to 6S an is in a of of of A of be by of to 0% 8%. of of By NA as of 8%, 72% 2%, 錄 第一章 引 言 . 1 1 16S 因克隆文庫 . 2 2遺傳指紋技術(shù)（ . 3 性梯度凝膠電泳（ . 4 鏈構(gòu)象多態(tài)性（ . 6 端限制性片段長度多態(tài)性（ . 6 機擴增多態(tài)性分析（ . 7 3核酸分子雜交技術(shù) . 7 點（ 交（點漬雜交） . 8 光原位雜交技術(shù)（ . 8 因芯片技術(shù)（ . 9 4實時熒光定量 術(shù)（ . 9 5微生物群落功能多樣性的研究 . 10 基因組文庫（ . 10 境基因組標簽法（ . 11 6問題與展望 . 12 本研究的目的和意義 . 13 第二章 胃腸道微生物生態(tài)研 究 . 14 第一節(jié) 山羊瘤胃微生物遺傳多樣性研究 . 14 1實驗材料 . 14 料 . 14 種和質(zhì)粒 . 14 具酶 . 14 器和試劑 . 14 液 . 14 養(yǎng)基 . 15 2研究方法 . 15 提取 . 15 增 . 15 泳凝膠制備 . 17 泳 . 17 泳條件 . 17 段的回收和連接 . 18 泳 . 18 收 . 18 段的連接 . 18 V 受態(tài)細胞的制備 . 18 轉(zhuǎn)化 . 19 組 純化 . 19 化 . 19 組 子篩選 . 19 序 . 20 譜中部分優(yōu)勢條帶的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析 . 20 3結(jié)果與分析 . 20 提取及 增 . 20 紋圖譜建立及分析 . 22 分優(yōu)勢條帶的序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分 析 . 28 4討論 . 29 第二節(jié) 草魚腸道細菌多樣性分析 . 32 1實驗材料 . 32 料 . 32 種和質(zhì)粒，工具酶，儀器和試劑，溶液，培養(yǎng)基 . 32 2研究方法 . 32 魚腸道的處理 . 32 提取 . 32 增 . 33 性梯度凝膠電泳 (. 33 段的回收和連接，感受態(tài)細胞的制備，電轉(zhuǎn)化，重組子篩選 . 33 序 . 33 譜中部分優(yōu)勢條帶的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析 . 33 3結(jié)果與分析 . 33 提取及 增 . 33 紋圖譜建立及分析 . 34 分優(yōu)勢條帶的序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析 . 36 4討論 . 37 本章小結(jié) . 40 第三章 草魚腸道產(chǎn)纖維素酶可培養(yǎng)細菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 . 41 1實驗材料 . 41 料 . 41 液 . 41 驗儀器 . 41 養(yǎng)基 . 41 2 研究方法 . 41 魚腸道的處理 . 41 維素酶產(chǎn)生菌株的分離 . 42 維素酶產(chǎn)生菌株的初篩 . 42 維素酶產(chǎn)生菌的純化 . 42 纖維素酶產(chǎn)生菌的保藏 . 42 因組總 提取 . 42 6S 增 . 42 段的回收 . 43 序 . 43 統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建 . 43 3結(jié)果與分析 . 43 株分離篩選結(jié)果 . 43 株 16S 定結(jié)果 . 43 菌基因組 提取結(jié)果 . 43 6S 增和測序 . 45 6S 列相似性比較以及系統(tǒng)發(fā)育學分析 . 46 4. 討論 . 48 本章小結(jié) . 50 第四章 . 51 1實驗材料 . 51 株與質(zhì)粒 . 51 物合成 . 51 劑盒、工具酶和生化試劑 . 51 2實驗方法 . 51 . 51 段的回收和連接，轉(zhuǎn)化，重組子篩選， 序 . 52 . 52 統(tǒng)進化樹分析 . 52 因文庫的構(gòu)建和篩選 . 52 3結(jié)果與分析 . 54 . 54 . 55 統(tǒng)進化樹分析 . 58 因文庫的構(gòu)建和篩選 . 58 列 . 59 4討論 . 65 本章小結(jié) . 68 第五章 結(jié)論 . 69 參考文獻 . 71 致謝 . 80 作者簡歷 . 81 中國農(nóng)業(yè)科學 院博士學位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 現(xiàn)代分子生物學技術(shù)在胃腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)研究中的應(yīng)用 二十一世紀人類面臨資源緊缺、環(huán)境污染、生態(tài)破壞等一系列嚴峻的挑戰(zhàn)。其中資源問題已經(jīng)成為人類社會，特別是 像 中國這樣的發(fā)展中人口大國可持續(xù)發(fā)展的最主要瓶頸 之一 。生物技術(shù)對于克服和解決這些問題具有無可替代的重要作用（孫國鳳 等 , 2005）。資源生物技術(shù)目前發(fā)展迅速，正在 醞釀重大突破，逐步形成生物技術(shù)的第三次浪潮，將對人類經(jīng)濟社會發(fā)展產(chǎn)生巨大的引領(lǐng)和帶動作用。 生物質(zhì)資源是地球上最重要的可再生性資源。隨著世界人口迅速增長、石油等礦產(chǎn)資源日漸枯竭，發(fā)展和提高人類生產(chǎn)和利用生物質(zhì)資源的能力，特別是發(fā)展能在干旱、鹽堿等貧瘠地區(qū)實現(xiàn)作物高產(chǎn)的高效農(nóng)業(yè)，和轉(zhuǎn)化生物質(zhì)資源為現(xiàn)代生物產(chǎn)品的高效生物加工業(yè)顯得特別重要（翁伯琦等 , 2006; 趙軍等 , 2007）。開發(fā)高效轉(zhuǎn)化可再生生物資源的微生物技術(shù)，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)人類急需的燃料、飼料及輕工、化工產(chǎn)品，可以推動未來經(jīng)濟體系的基 礎(chǔ)從逐漸枯竭的石油資源向可再生的生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化，構(gòu)建可持續(xù)發(fā)展的循環(huán)型社會，具有極其重要的意義和光明的發(fā)展前景 （石元春 , 2005） 。 微生物是地球上最早的生命形式，在數(shù)十億年的進化過程中，形成了適應(yīng)各種環(huán)境的生理和分子機制，占據(jù)了地球幾乎所有環(huán)境，包括沒有其它生命形式能夠共存的極端環(huán)境。微生物支撐著整個地球上的物質(zhì)循環(huán)和生命的持續(xù)，其多樣性被用于監(jiān)視和預測環(huán)境變化，也是新基因資源的重要來源（ et 2002; et 2007）。尤其人類和動物胃腸道中棲息著大量 的微生物，它們在營養(yǎng)、生理、免疫等方面對宿主起著有益作用 （ et 1997; et 2004, 2006） 。雖然傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法已經(jīng)解開了大量微生物的很多秘密，但是人們對胃腸道微生物了解還很有限，其原因有很多方面： 1 由于長期進化，微生物通常是在特定環(huán)境條件下才能正常生長和繁殖，迄今，通過分離、培養(yǎng)，只有很少數(shù)的微生物得到了鑒定和描述，而絕大多數(shù)微生物仍然是未知的； 2 很多研究證明，自然界中很多微生物不能人工培養(yǎng)，成為不可培養(yǎng)微生物 （ et 1995） ； 3 人為培養(yǎng)的微生物與其自然界菌體在形態(tài)和特征上差異明顯 （ et 1984; et 1987）。微生物生態(tài)的監(jiān)測及其群落多樣性分析是微生物生態(tài)學研究所采用的重要技術(shù)手段和內(nèi)容，其最終目的是快速、準確鑒定在自然生態(tài)環(huán)境或