1、植化方法學(xué)(一)天然藥物化學(xué)教研室邱 峰2010年 3月1植化方法學(xué)涉及內(nèi)容藥材提取物單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定分離分離化學(xué)及波譜學(xué)提取提取2如何開展研究如何開展研究-注意點(diǎn)注意點(diǎn)查閱文獻(xiàn)，了解研究現(xiàn)狀查閱文獻(xiàn)，了解研究現(xiàn)狀1）、同種同屬植物的相關(guān)文獻(xiàn)2）、某類成分的相關(guān)文獻(xiàn)根據(jù)不同目的，確定實(shí)驗(yàn)方案根據(jù)不同目的，確定實(shí)驗(yàn)方案1）、化學(xué)成分系統(tǒng)研究2）、某類化學(xué)成分的分離3）、某種已知化學(xué)成分的分離4）、活性成分的追蹤分離預(yù)試或小試預(yù)試或小試1）、含有化學(xué)成分性質(zhì)和類別2）、為放大試驗(yàn)而進(jìn)行的小試3植化方法學(xué)（一）植化方法學(xué)（一）（各種色譜的分離原理及操作）（各種色譜的分離原理及操作）一、硅膠相關(guān)色譜

2、二、氧化鋁相關(guān)色譜三、聚酰胺柱色譜四、葡聚糖凝膠柱色譜五、大孔吸附柱色譜六、離子交換柱色譜七、反應(yīng)薄層色譜八、提取方法4一、硅膠相關(guān)色譜1、硅膠的結(jié)構(gòu)、硅膠的結(jié)構(gòu)(SiO2.XH2O)OSiOSiOHOOOO5植化方法學(xué)（一）植化方法學(xué)（一）（各種色譜的分離原理及操作）（各種色譜的分離原理及操作）一、硅膠相關(guān)色譜二、氧化鋁相關(guān)色譜三、聚酰胺柱色譜四、葡聚糖凝膠柱色譜五、大孔吸附柱色譜六、離子交換柱色譜七、反應(yīng)薄層色譜八、提取方法62、分離原理、分離原理吸附作用：氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等吸附強(qiáng)度的大小取決于硅醇基類型、硅醇基數(shù)目（比表面積）、孔體積、平均孔徑3、使用范圍、使用范圍 由于硅膠

3、的弱酸性、往往適合于分離黃酮黃酮、香香豆素豆素、蒽醌蒽醌、萜萜、甾體甾體等中性或弱酸性類化合物中性或弱酸性類化合物。78黃連生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)黃連生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)9薄層板薄層板： 硅膠G薄層板， 110 C 活化1小時(shí)展開劑展開劑：乙酸乙酯-氯仿-甲醇-濃氨水-二乙胺（8:2:2:1:0.5）檢測方式檢測方式：UV366nm黃連生物堿硅膠薄層色譜圖譜黃連生物堿硅膠薄層色譜圖譜104、常用硅膠的規(guī)格、常用硅膠的規(guī)格100140目、100200目（75150m）、200300目（4575 m ）為開放柱色譜用硅膠開放柱色譜用硅膠1040m為薄層色譜用硅膠210 m為高效薄層色譜或液相色譜用硅膠5、薄

4、層色譜硅膠的種類、薄層色譜硅膠的種類硅膠G:含有石膏1214%，粒度1040m，pH67(10%)。硅膠H:不含石膏，pH67(10%)。硅膠GF254:含有石膏1214%，pH67(10%)，且含有少量的熒光劑。116、硅膠含水量與活性之間的關(guān)系、硅膠含水量與活性之間的關(guān)系12細(xì)玻璃管法測定硅膠活性細(xì)玻璃管法測定硅膠活性 展開劑：苯展開劑：苯137、含水硅膠色譜、含水硅膠色譜 硅膠含水達(dá)17%以上為分配色譜，適宜分離生物堿、糖類、皂苷、有機(jī)酸等。表現(xiàn)在薄層和開放柱上，展開劑或洗脫劑為多相含水系統(tǒng)。薄層板薄層板：硅膠H展開劑展開劑： I: 正丁醇-乙酸乙酯-水 （4:1:1） II: 氯仿-甲

5、醇-水 （65:35:10）下層顯色顯色：10%硫酸1415Oleanane-type and Protopanaxatriol-type Saponins from Panax ginseng16Panaxadiol-type Saponins from Panax ginseng178、硅膠制備薄層色譜、硅膠制備薄層色譜操作方法1)、薄層的制備薄層的制備 2020cm2的玻璃板一般所用硅膠量為820g，5CMCNa的用量按1:22.5為宜，晾干，根據(jù)需要可進(jìn)行活化。2)、點(diǎn)樣（點(diǎn)樣（1050mg） 用玻璃毛細(xì)管或移液管將樣品溶液線形點(diǎn)樣于硅膠板上，點(diǎn)樣線寬度要適宜，過窄易超載，過寬影響分離

6、效果。3)、展開展開 晾干點(diǎn)樣處溶劑后，以選好的展開劑進(jìn)行展開，對有些化合物預(yù)飽和一段時(shí)間，分離效果更好。原點(diǎn)前沿184)、標(biāo)記色帶標(biāo)記色帶 取出薄層板，晾干，根據(jù)熒光畫出色帶，或部分顯色確定色帶的位置。5)、剝離、提取剝離、提取 剝離色帶部分的硅膠，以合適的溶劑直接提取或裝入小玻璃柱進(jìn)行洗脫。（忌用含水系統(tǒng)處理）6)、濃縮濃縮 濃縮提取液或洗脫液得色帶對應(yīng)的化合物。多數(shù)情況下，需要進(jìn)一步的精制或純化處理。8、制備薄層色譜操作、制備薄層色譜操作原點(diǎn)前沿19制備薄層色譜展開后處理制備薄層色譜展開后處理20 9、硅膠柱色譜的操作（開放柱色譜）硅膠柱色譜的操作（開放柱色譜）1)、拌樣（干法上樣）拌樣

7、（干法上樣）： 將分離樣品溶于易揮散溶劑中，與三倍量的柱層析硅膠拌樣。滴加樣品溶液的同時(shí)應(yīng)不斷攪拌均勻，一旦達(dá)到制劑軟材程度應(yīng)停止滴加樣品溶液，晾干或低溫干燥（注意有毒溶劑的處理）后再繼續(xù)操作，直到樣品溶液全部加入。2)、裝柱裝柱： 將拌樣硅膠1020倍量的柱色譜硅膠浸泡于起始溶劑起始溶劑中，攪拌趕出氣泡，裝入準(zhǔn)備好的玻璃柱中，平衡至不再下降為止。3)、上樣上樣： 待硅膠柱平衡好后，將干燥好的拌樣硅膠用漏斗加入柱子上部（加入前要保證起始溶劑在柱子中足夠的高度以免帶入氣泡）。4)、加入保護(hù)硅膠或棉花加入保護(hù)硅膠或棉花：用起始溶劑洗脫至柱中上端溶劑顏色變淺或無色為止，然后加入適量硅膠或棉花起緩沖作

8、用。215)、柱色譜洗脫劑的選擇柱色譜洗脫劑的選擇 起始溶劑原則上對被分離樣品中的任何物質(zhì)都沒有洗脫能力。洗脫溶劑的選擇以硅膠薄層板的色譜行為為先導(dǎo)，被分離成分的Rf值一般在0.10.2為宜（理論上為0.20.3）。22“注注”：展開劑和洗脫劑的選擇最好參考文獻(xiàn)資料。6)、更換洗脫劑更換洗脫劑 在一個(gè)洗脫劑系統(tǒng)下，一般要求至少洗脫35個(gè)保留體積，實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)具體情況決定是否更換，比如到5個(gè)保留體積還有較大量的的物質(zhì)被洗脫下來，就應(yīng)當(dāng)繼續(xù)洗脫下去。7)、保留體積的估算保留體積的估算 浸泡硅膠的溶劑量 + 空柱溶劑量柱床上端溶劑量 =保留體積8)、流速的提高流速的提高：柱上端加壓或下段流出口減壓，

9、特別是填料硅膠粒度小時(shí)可采用這兩種方式加快洗脫速度。9)、合并相同流份合并相同流份：硅膠薄層色譜指導(dǎo)合并，流份體積根據(jù)硅膠柱大小和分離樣品量確定。2310、硅膠中低壓柱色譜及高效液相色譜、硅膠中低壓柱色譜及高效液相色譜1)、流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇： 通過硅膠薄層摸索液相色譜條件，最好用高效薄層指導(dǎo)來選擇流動(dòng)相，其粒度接近于制備色譜柱填料，用自制的硅膠薄層選用自制的硅膠薄層選擇流動(dòng)相時(shí)注意粒度和含有水分的影響擇流動(dòng)相時(shí)注意粒度和含有水分的影響。另外也可用同類型填料的分析柱摸索流動(dòng)相條件。2)、樣品溶液的處理樣品溶液的處理： 盡可能選擇流動(dòng)相溶解樣品，并用微孔過濾器過濾。選擇極性大于流動(dòng)相的溶劑

10、配制樣品溶液會(huì)因進(jìn)樣量的不同影響保留時(shí)間和分離效果。3)、檢測器的選擇檢測器的選擇： 有紫外吸收的物質(zhì)盡可能用紫外檢測器，無紫外吸收的或紫外吸收較弱的可選用示差 檢測器。目前出現(xiàn)的蒸發(fā)光散射檢測器則是幾乎對所有的非揮發(fā)性天然化合物適用。2411、硅膠干柱法（適用于有顏色或熒光的物質(zhì)分離）、硅膠干柱法（適用于有顏色或熒光的物質(zhì)分離）干柱色譜的優(yōu)點(diǎn)：干柱色譜的優(yōu)點(diǎn)：1)、分離效果比濕裝柱高。、分離效果比濕裝柱高。2)、洗脫液的選擇可直接套用薄層色譜的最佳分離、洗脫液的選擇可直接套用薄層色譜的最佳分離 條件。條件。3)、常采用塑料薄膜柱，對有熒光或顏色的物質(zhì)，常采用塑料薄膜柱，對有熒光或顏色的物質(zhì)，

11、 可借助紫外燈分割各色帶，避免交叉?？山柚贤鉄舴指罡魃珟В苊饨徊?。4)、適用于制備性分離。適用于制備性分離。5)、設(shè)備簡單，消耗溶劑少，節(jié)省時(shí)間。設(shè)備簡單，消耗溶劑少，節(jié)省時(shí)間。25硅膠干柱法的操作硅膠干柱法的操作1)、填充填充： 將硅膠填料（可用柱色譜硅膠）裝入玻璃柱或透明塑料薄膜柱中，注意不要留有空隙。2)、上樣上樣： 將拌樣硅膠均勻地加入柱的上端，并在拌樣硅膠的上方加入與柱內(nèi)徑相同大小的原形濾紙。3)、展開展開： 將制備薄層展開劑條件直接用于干柱色譜上，配好足量的展開劑用分液漏斗滴加入柱中，待展開劑滲透到柱子的下端，即停止滴加。264)、分割分割： 根據(jù)色帶或熒光帶做好標(biāo)記，然后用彎

12、勺取出各標(biāo)記帶對應(yīng)的硅膠（玻璃柱），塑料薄膜柱可直接切割。5)、洗脫洗脫： 用合適的溶劑提取色帶或熒光帶硅膠，也可裝入小玻璃柱用溶劑洗脫下來?！白⒁恻c(diǎn)注意點(diǎn)”：a ：上樣量比正常的硅膠柱色譜要少，一般1:1001:300；b ：上柱硅膠的粒度越小效果越好，一般常用100140目的柱色譜硅膠，大的開放柱粒度要大些。2712、與硅膠相關(guān)的反相色譜填料、與硅膠相關(guān)的反相色譜填料常用的反相填料有RP-18(ODS)、RP-8和RP-22813、反相分離色譜柱操作上的注意點(diǎn)、反相分離色譜柱操作上的注意點(diǎn)1)、流動(dòng)相為含水系統(tǒng)，同樣可由相應(yīng)的TLC確定柱色譜的分離條件，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、四氫呋喃

13、。2)、柱色譜的填料最好以甲醇浸泡上柱，然后用甲醇洗脫23個(gè)保留體積，再用水置換出甲醇備用。3)、樣品最好用流動(dòng)相溶解，盡可能避免溶解在有機(jī)溶劑的比例大于流動(dòng)相的溶液中。4)、對一些酸堿性物質(zhì)，為了使峰形變銳，有時(shí)流動(dòng)相加入少量的酸或水，或需配成緩沖溶液（普通的反相色譜柱可耐受的pH為29），實(shí)驗(yàn)完畢沖洗柱子時(shí)一定要先用水，然后用醇。29常見高效液相色譜柱的種類常見高效液相色譜柱的種類30鑒定化合物純度的方法1、熔點(diǎn)測定法2、薄層色譜法 3、高效液相色譜法4、核磁共振法4、電泳法31D1 cyclohexane:ethyl acetate(15:1)Minutes123456789Volts-

14、0.050.000.050.100.150.20Volts-0.050.000.050.100.150.20Detector Aacb-53acb-53-60%-002Detector Aacb-531acb-531-60%-001Detector Aacb-532acb-532-60%-001Detector Aacb-535acb-535-60%-001Detector Aacb-536acb-536-60%-001Detector Aacb-537acb-537-60%-001HPLC結(jié)合結(jié)合TLC鑒定樣品純度實(shí)例鑒定樣品純度實(shí)例32核磁共振法判斷樣品純度核磁共振法判斷樣品純度33核磁共

15、振法判斷樣品純度核磁共振法判斷樣品純度34二、氧化鋁相關(guān)色譜二、氧化鋁相關(guān)色譜1、層析色譜用氧化鋁規(guī)格和種類薄層：200300目柱層：60100目，100200目1)、堿性氧化鋁：pH910，直接由氫氧化鋁高溫脫水制得。適用于對堿溶液比較穩(wěn)定的中性色素、甾族化合物、生物堿、醇以及其它中性、堿性物質(zhì)的分離。2)、中性氧化鋁：可由堿性氧化鋁水洗至pH7.5，經(jīng)活化制得。中性氧化鋁使用最廣，適于醛、酮、醌、某些苷及酸堿溶液中不穩(wěn)定的化合物如酯、內(nèi)酯等化合物的分離。3)、酸性氧化鋁：加入2N鹽酸處理，使水提液的pH為44.5，經(jīng)活化制得。適用于酸性色素及某些醛酸的分離。352、氧化鋁的含水量與活性、氧

16、化鋁的含水量與活性363、氧化鋁活性的測定、氧化鋁活性的測定細(xì)玻璃管法（展開劑：苯）細(xì)玻璃管法（展開劑：苯）374、氧化鋁的再生氧化鋁的再生 用甲醇、稀醋酸、氫氧化鈉溶液及水洗滌，再經(jīng)高溫活化后，可重復(fù)使用。5、氧化鋁應(yīng)用的局限性 一些酚性化合物（部分黃酮、香豆素類）、酸性物質(zhì)（部分三萜酸）能與氧化鋁結(jié)合。此外，層析過程中引起的異構(gòu)化、氧化、皂化、水合，以及脫氯化氫形成雙鍵等反應(yīng)，應(yīng)引起操作者的注意。38394041三、聚酰胺相關(guān)柱色譜三、聚酰胺相關(guān)柱色譜1、聚酰胺的結(jié)構(gòu)常用有錦綸6(聚己內(nèi)酰胺)和錦綸錦綸66(聚己二酰己二胺聚己二酰己二胺)422、聚酰胺的分離原理1) 反相色譜（流動(dòng)相：含水

17、溶劑）反相色譜（流動(dòng)相：含水溶劑）：a、氫鍵吸附：聚酰胺分子內(nèi)的酰胺鍵，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵，因而產(chǎn)生吸附作用。b、非極性固定相：聚酰胺非極性脂肪鏈。2) 正相色譜（流動(dòng)相：有機(jī)溶劑）正相色譜（流動(dòng)相：有機(jī)溶劑）：極性小的化合物先被洗脫下來，表現(xiàn)在薄層色譜上比移值較大。3、聚酰胺適用范圍黃酮、酚類、蒽醌類、萜類、甾體、生物堿、糖類等物質(zhì)的分離；去鞣質(zhì)。434、聚酰胺的規(guī)格、聚酰胺的規(guī)格柱色譜聚酰胺 2040目，60100目，100200目薄層色譜聚酰胺 200300目5、聚酰胺粉的預(yù)處理聚酰胺粉的預(yù)處理 聚酰胺粉（錦綸）中常有兩種雜質(zhì)：原料單體、小分子聚合物和蠟質(zhì)，在使用

18、前需要預(yù)處理。操作方法操作方法： 1)、以90%95%的乙醇浸泡，攪拌，除去氣泡后裝入柱中，用醇洗至洗液透明并在蒸干后無殘?jiān)驑O少量，一般至少洗脫34倍的體積。2)、依次用23倍體積的5%NaOH水溶液、2倍體積的蒸餾水、23倍體積的10%醋酸水溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性。446、聚酰胺柱色譜操作1) 裝柱裝柱：以含水溶劑系統(tǒng)為洗脫劑，常以水裝柱（反相色譜）；若以有機(jī)溶劑系統(tǒng)為洗脫劑，常以極性較小的起始溶劑裝柱（正相色譜）。2) 加樣加樣：100ml的聚酰胺可吸附1.52.5g。干法上樣可參照硅膠柱色譜；濕法上樣多用于反相色譜，樣品溶于或至少均勻分散在水溶液中。3) 洗脫洗脫：根據(jù)聚酰胺薄

19、層色譜結(jié)果確定柱色譜的條件。反相色譜一般用水、稀至濃的乙醇；正相色譜一般用氯仿、氯仿-甲醇的混合溶劑。4) 再生再生：5%NaOH洗滌至溶液顏色變淡，然后蒸餾水洗至pH89，再以2倍量10%醋酸洗脫，最后以蒸餾水洗至中性。45464748 四、葡聚糖凝膠柱色譜四、葡聚糖凝膠柱色譜1、交聯(lián)葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、交聯(lián)葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)492、常用葡聚糖凝膠種類、分離原理、常用葡聚糖凝膠種類、分離原理 Sephadex G 系列系列分子篩分子篩50葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G系列的性質(zhì)系列的性質(zhì)51Sephadex LH20分子篩和反相分配色譜分子篩和反相分配色譜 羥丙基交聯(lián)葡聚糖凝膠，吸水量每克2ml?？稍谒?/p>

20、和有機(jī)溶劑中使用，洗脫劑的選擇從被分離物質(zhì)的性質(zhì)和溶解度兩方面考慮。523、葡聚糖凝膠柱色譜的操作、葡聚糖凝膠柱色譜的操作Sephadex LH201)、柱子的選擇、柱子的選擇 細(xì)長柱(長11.5m，直徑23cm)2)、 浸泡浸泡 用上柱的洗脫溶劑浸泡34小時(shí)（分離小分子的G-10、15和LH20），然后攪拌排氣泡。3)、 裝柱裝柱 空柱加洗脫液1/4左右，盡可能一次性加入所有凝膠，沉降、平衡至柱床不再下降為止。柱床越高，分離效果越好。534)、加樣、加樣 待液面離柱床表面12mm時(shí)，用滴管加入樣品溶液（洗脫劑溶解），樣品溶液要盡量體積小、濃度大樣品溶液要盡量體積小、濃度大。5)、洗脫、洗脫 洗脫劑的選擇根據(jù)上柱樣品的性質(zhì)和樣品的溶解度。分離中性物質(zhì)可選擇水、電解質(zhì)和緩沖液；對阻滯較強(qiáng)的組分，可選擇含水有機(jī)溶劑，或單用有機(jī)溶劑。6)、收集和檢出收集和檢出 帶有顏色的物質(zhì)可根據(jù)外觀色帶判斷； 有強(qiáng)UV吸收的物質(zhì)可用紫外燈照射來區(qū)分色譜帶； 無或較弱紫外吸收的物質(zhì)可用薄層