1、代謝物的測(cè)定-理論知識(shí)部分一相關(guān)定義與前言 藥物進(jìn)入體內(nèi)后一般需經(jīng)歷物理變化和化學(xué)變化,物理變化是指藥物與生物大分子如血漿蛋白的結(jié)合反應(yīng)；化學(xué)變化是指體內(nèi)代謝反應(yīng)。 體內(nèi)代謝反應(yīng)也稱生物轉(zhuǎn)化，分為一相代謝和二相代謝，一相代謝是指藥物在體內(nèi)發(fā)生的氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、水解反應(yīng)。二相代謝是指藥物在體內(nèi)的結(jié)合反應(yīng)，包括：葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化、甲基化、乙酰基化、氨基酸綴合、谷胱甘肽綴合等。 體內(nèi)藥物及其代謝產(chǎn)物的分析研究將為藥濃度、藥效和毒性之間的關(guān)系，為藥物作用機(jī)理及藥代動(dòng)力學(xué)的研究提供科學(xué)的依據(jù)，因此近年來的進(jìn)展令人矚目， 已成為藥物研究的重要分支，并形成了一門新型的學(xué)科。1.1本節(jié)有關(guān)定義生物

2、利用度(Bioavailability)：劑型中的藥物被吸收進(jìn)入血液的速率和程度。生物等效性(Bioequivalence)：一種藥物的不同制劑在相同的試驗(yàn)條件下，給以相同的劑量，反映其吸收速率和程度的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。二研究代謝物測(cè)定的意義2.1測(cè)定藥物及其代謝物在血液組織及臟器內(nèi)的分布量，是衡量藥物的有效性和安全性的重要指標(biāo)；2.2測(cè)定藥物及其代謝物濃度的經(jīng)時(shí)變化，提供可靠的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)；2.3研究藥物的代謝途徑，代謝物的藥理活性，生成與消除速度，對(duì)于合理用藥，避免藥物的毒性以及尋找新藥有一定意義。2.4有利于生物樣品的保存 當(dāng)生物樣品如血液采集之后，血漿酯酶有可能繼續(xù)

3、水解樣品中的酯類藥物，其他酶類也可能對(duì)樣品藥物繼續(xù)產(chǎn)生代謝反應(yīng)，因此，常需加入酶抑制劑。2.5有利于分析方法選擇 大多數(shù)藥物的體內(nèi)代謝反應(yīng)，只是藥物分子結(jié)構(gòu)上某些基團(tuán)的改變，使代謝物與母體藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分相似，從而導(dǎo)致某些物理性質(zhì)無較大差異，光譜分析及免疫分析法經(jīng)常面臨代謝物的干擾，欲測(cè)定生物樣品中的藥物和代謝物含量時(shí)，應(yīng)用色譜法是適當(dāng)?shù)倪x擇，因其具備分離、分析功能，能避開代謝物的干擾或直接測(cè)定代謝物。2.6有利于選擇樣品分離、提取的方法 藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后，生成的代謝物一般極性增大，水溶性增強(qiáng)，因此將藥物自生物樣品中分離、提取時(shí)，常利用它們之間極性和離解行為為的差別，選擇適當(dāng)pH的緩沖液和溶

4、劑系統(tǒng)將其分開。三體內(nèi)代謝物需要被測(cè)定的情況3.1在做藥物的1期臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)時(shí)，如果已知有活性代謝物（藥理和毒理），并且濃度足夠高，可以測(cè)定 a）研究的是其藥代情況，需要測(cè)定代謝物 b）僅僅做生物等效性實(shí)驗(yàn)，并且原藥可以測(cè)定時(shí)可以不測(cè)定代謝產(chǎn)物如果已知有活性代謝物，但是濃度低，不易測(cè)定，可以不測(cè)定如果代謝產(chǎn)物會(huì)影響藥物的代謝，分布和排泄時(shí)，在研究其藥代特征時(shí)應(yīng)該考慮進(jìn)行代謝產(chǎn)物測(cè)定 但是代謝產(chǎn)物是否在人體具有活性很難判斷，因?yàn)槠涫欠裼谢钚跃怯善渑R床前資料支持的。這時(shí)候可以參考05年3月版的化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則和FDA的Bioavailability and Bioeq

5、uivalence Studies for Orally Administered Drug Products - General Considerations（2003年）3.2在對(duì)生物樣品中代謝物濃度的檢測(cè)時(shí)，代謝物能影響藥物的安全性和有效性時(shí): 藥代動(dòng)力學(xué)研究:同時(shí)測(cè)定母體藥物和代謝物的濃度， 等效性試驗(yàn):同時(shí)測(cè)定母體藥物和代謝物的濃度,等效性評(píng)價(jià)時(shí)以母體藥物作為主要判斷指標(biāo)。主要代謝物活性不清楚時(shí): 藥代動(dòng)力學(xué)研究:測(cè)定母體藥物和代謝物濃度， 等效性試驗(yàn):測(cè)定母體藥物濃度。前藥濃度很低,代謝物為體內(nèi)主要存在形式時(shí): 藥代動(dòng)力學(xué)研究:測(cè)定母體藥物和代謝物濃度， 等效性評(píng)價(jià):測(cè)定代謝物的濃

6、度。前體藥物: 藥代動(dòng)力學(xué)研究:測(cè)定母體藥物(如果能測(cè)到)和代謝物濃度， 等效性試驗(yàn):測(cè)定代謝物濃度。4 代謝物測(cè)定時(shí)常用的生物樣本 代謝物測(cè)定時(shí)常用的生物樣本血樣（血漿、血清和全血）、尿樣、唾液。常用生物樣本的采集與儲(chǔ)存：血漿全血加抗凝劑，離心，取上清液；血清全血離心，取上清液。采血后必須盡快離心分離出血漿或血清，置20以下冷凍保存。尿樣收集服藥后一定時(shí)間內(nèi)尿樣，記錄體積，混合均勻后取一定量,測(cè)定尿中藥物濃度，計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)尿中藥物的累積量。唾液漱口15分鐘后收集口內(nèi)自然流出或經(jīng)舌在口內(nèi)攪動(dòng)后流出的混合唾液，離心后取上清液。樣本采集后不能及時(shí)測(cè)定，可置4冷藏，若放置時(shí)間較長(zhǎng)，則需-20-80

7、冷凍保存。五.代謝物測(cè)定的方法 代謝產(chǎn)物的測(cè)定是藥物代謝研究中最經(jīng)典、同時(shí)也是十分有效的方法之一。 由于藥物最終會(huì)通過與母核相關(guān)的一種或多種代謝物排出體外，因此，分離鑒定測(cè)定代謝產(chǎn)物可在一定程度上了解藥物的代謝途徑。近年來，HPLC,GC-MS,LC-MS及GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR及LC-MS-NMR等高速、高效、高靈敏度的分析方法已用于代謝產(chǎn)物的分析和測(cè)定。5.1.HPLC的方法 由于體液中藥物及代謝產(chǎn)物含量極微， 又與大量?jī)?nèi)源性成分相混雜， 因此， 只有分析方法可靠才能保證分析結(jié)果準(zhǔn)確。氣相色譜- 質(zhì)譜法（GC-MS）是分析微量乃至超微量化合物的有力工具，在這一領(lǐng)域

8、中應(yīng)用頗多。但是許多藥物和代謝產(chǎn)物缺乏揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性， 限制了它的應(yīng)用。近年來，高效液相色譜法(HPLC)以適用范圍廣、分離效率高、組分易回收及快速簡(jiǎn)便為特點(diǎn)，伴以靈敏度高、選擇性強(qiáng)的檢測(cè)器的開發(fā)和應(yīng)用，在諸多的分析方法中后來居上，成為分析體內(nèi)藥物代謝產(chǎn)物的不可缺少的手段之一。因?yàn)轶w內(nèi)藥物及代謝產(chǎn)物含量甚微，很難收集到足夠的樣品量測(cè)定四大光譜即紅外、紫外、核磁共振和質(zhì)譜。因此，以HPLC為工具定未知物就成為需要解決的難題之一。LC-MS雖然有效，卻因儀器價(jià)格昂貴不能廣泛應(yīng)用。目前仍常用以經(jīng)驗(yàn)推斷的化合物為對(duì)為了去除內(nèi)源性成分的干擾，保證色譜柱的柱效和壽命， 進(jìn)行生物樣品的前處理是極其重要的。

9、5.1.1分離 對(duì)于選用的不同的生物樣品類型進(jìn)行不同的預(yù)處理。如血樣（包括血清、血漿）可直接上樣進(jìn)行固相萃取，但若藥物與蛋白結(jié)合，則會(huì)降低萃取回收率，故要去除代謝物中蛋白質(zhì)，使結(jié)合型藥物釋放出來，以測(cè)定總濃度。得到較“干凈”的提取液，減少乳化，消除對(duì)測(cè)定的干擾。而唾液樣品則主要采用離心沉淀除去粘蛋白，取上清液測(cè)定藥物濃度。要測(cè)定尿液中的綴合物常需采用酸水解法或酶水解法使綴合物水解。常用去蛋白質(zhì)方法：蛋白質(zhì)沉淀法生成不溶性鹽或鹽析和脫水作用。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑包括有機(jī)溶劑（乙腈、甲醇、乙醇及丙酮等）、碳酸銨鹽、無機(jī)酸（三氯乙酸、高氯酸等）和重金屬鹽（汞鹽、鎢酸鹽及銅鹽等）。由于經(jīng)有機(jī)溶劑或酸處理

10、后的生物樣品與反相HPLC分析相匹配，因此應(yīng)用最為廣泛。組織酶消化法蛋白水解酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 近年來，用微孔膜濾除蛋白質(zhì)的方法已見報(bào)道，具有簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，但只能測(cè)定游離狀態(tài)的化合物。用酸堿性離子交換樹脂去除與堿酸性化合物共存的蛋白質(zhì)，可同時(shí)完成純化和富集過程,因此也常被應(yīng)用。 提取從生物樣品中提取待測(cè)物通常有液相提取和固相提取兩種，分析超微量化合物時(shí)尤為必要。液相提取亦即溶劑提取，常用的有機(jī)溶劑有：正醇、二氯甲烷、氯仿、 乙酸乙酯、乙醚、苯及正己烷等等以及它們的混合溶液。有時(shí)為了減少乳化可加入少量的甲醇或乙醇。為了有效地提取酸、堿性藥物，通常需要調(diào)節(jié)樣品的p H， 堿藥物一般調(diào)至

11、高于其pKa 12個(gè)單位，酸性藥物則調(diào)至低于其pKa12個(gè)單位， 使藥物處于非解離狀態(tài)而易被提取。 提取高度電離的化合物（如季銨鹽或磺酸鹽） 以及兩性化合物（如氨基酸）時(shí)，則須加入離子對(duì)試制。酸性化合物一般選用季銨鹽或叔銨鹽，堿性化合物則選用烷基或芳基磺酸鹽類以形成離子對(duì)，提高有機(jī)溶劑由于有機(jī)溶劑一般有毒易燃， 蒸發(fā)去除溶劑可能引起待測(cè)物損失以及有時(shí)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象等，因此，更為簡(jiǎn)便有效的提取方法成為尋求的目標(biāo)。其中固相提取法顯示出廣闊的前景。經(jīng)典的固相提取劑有氧化鋁、活性炭及硅藻土等。由于氧化鋁能選擇地吸附鄰酚羥基化合物，因此至今仍常使用，通常在弱堿性介質(zhì)ph8左右）中進(jìn)行吸附，水洗去雜質(zhì)后用酸

12、洗脫待測(cè)物。影響液-液提取的因素：有水相pH 值、提取溶劑和離子強(qiáng)度等1) 水相pH堿性藥物：PH高于藥物的pKa 23單位；酸性物質(zhì)：pKa 23單位2) 提取溶劑提取溶劑的選擇既要考慮提取的選擇性，同時(shí)也要考慮操作是否方便，在滿足提取效率的同時(shí)選取極性盡可能小的溶劑，使既有合適的回收率，又可將干擾物質(zhì)降到最低。一般可根據(jù)相似相溶原則進(jìn)行選擇，選擇沸點(diǎn)低的溶劑。當(dāng)樣品中藥物性質(zhì)未知時(shí)，可用乙醚、氯仿分別作為酸性和堿性藥物的提取溶劑。 3) 離子強(qiáng)度 在水相中加中性鹽，如NaCl，可增加離子強(qiáng)度，使溶液中水分子與無機(jī)離子強(qiáng)烈締合，導(dǎo)致與藥物締合的水分子減少，使藥物在水相中溶解度變小，有利于有機(jī)

13、溶劑提取。4）有機(jī)相和水相體積 1:1或2:1影響液-固提取的因素：分離度和回收率是反映提取效率的重要指標(biāo)，影響提取率的主要因素是：1）洗脫液流速流速太快，分離度下降，樣品流失，回收率低，重現(xiàn)性差。2）樣品裝載量有效裝載量取決于被測(cè)物的容量因子、固定相量和樣品濃度。過載，導(dǎo)致樣品流失。根據(jù)藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等選擇其預(yù)處理及檢測(cè)方法 A）具有親脂性的藥物在適當(dāng)?shù)膒H值下用溶劑萃取 B）具有強(qiáng)極性或親水性的藥物選擇沉淀蛋白、固相萃取、離子對(duì)萃取或衍生化后萃取的方法等 C）具有揮發(fā)性的藥物選擇GC測(cè)定法 D）具有光譜或電化學(xué)特性選擇分析檢測(cè)方法E）要根據(jù)藥物的穩(wěn)定性選擇萃取濃縮技術(shù)：對(duì)酸堿不穩(wěn)定避免使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶劑，對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物避免高溫蒸發(fā)溶劑， 對(duì)光不穩(wěn)定的藥物避免見光。樣品處理步驟與分析方法的選擇如下圖所示5.2其他測(cè)定代謝物的方法 由于藥物最終會(huì)通過與母核相關(guān)的一種或多種代謝物排出體外，因此，分離鑒定代謝產(chǎn)物可在一定程度上了解藥物的代謝途徑。這時(shí)也可用特殊的分