1、Application of Real-Time Cell Electronic Sensing (RT-CES) Technology to Cell-Based Assays將實(shí)時(shí)細(xì)胞電子傳感技術(shù)(RT-CES)應(yīng)用到細(xì)胞檢測中李雪瑩 41113107介紹材料和方法 RT-CES系統(tǒng) 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)材料 數(shù)據(jù)分析結(jié)果和討論 RT-CES的原理 細(xì)胞增長率的測量 LTK細(xì)胞的 毒性和保護(hù)作用 細(xì)胞有絲分裂抑制因素的實(shí)驗(yàn) A2780細(xì)胞凋亡的感應(yīng)總結(jié)Introduction 隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，人們找到了更多的基因靶點(diǎn)以用于藥物治療，這導(dǎo)致了對新型藥物需求的快速增長。這就需要一

2、種可以快速高效地找到治療靶點(diǎn)對應(yīng)化合物的檢測方法。包含對信號分析、通路分析、離子通道分析、細(xì)胞成像分析的細(xì)胞功能性檢測已經(jīng)成為尋找新型藥物的首選。 普通的篩選細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用示蹤物（放射性同位素、光吸收、熒光、冷光標(biāo)記等）來檢測多種細(xì)胞功能，但這種方法不僅費(fèi)時(shí)，還增加了實(shí)驗(yàn)復(fù)雜程度，干擾性也增加。近幾年興起的無標(biāo)記檢測技術(shù)（應(yīng)用比色共振反射來直接測量細(xì)胞相互作用；測量細(xì)胞光、聲方面的移動性來進(jìn)行optophoresis 細(xì)胞分析；基于細(xì)胞基質(zhì)阻抗測量 的電子測量）。 比色共振反射：普通熒光分光光度儀研究卟啉在核酸分子上的J型堆積時(shí)會產(chǎn)生的增強(qiáng)的光散射信號 。optophoresis 細(xì)胞分析：opt

3、ophoresis是一種非侵入性的細(xì)胞分析技術(shù)是基于活全細(xì)胞與光學(xué)梯度域的相互作用，通常產(chǎn)生的近紅外激光。 無標(biāo)記檢測的潛在好處在于同一的實(shí)驗(yàn)條件、無創(chuàng)傷性測試且實(shí)時(shí)收集信息量大、外部條件干擾少。先介紹electrical cellsubstrate impedance sensing電子細(xì)胞基質(zhì)阻抗傳感(ECIS) 。 傳統(tǒng)的ECIS系統(tǒng)中，一個(gè)大面積參考電極和一個(gè)或多個(gè)小的檢測電極(小于0.1%底面積)固定在細(xì)胞培養(yǎng)皿底部。通過測量參考和檢測電極之間的阻抗的變化可以實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞的粘附、分離、擴(kuò)散、微移動。雖然這樣有很多優(yōu)點(diǎn)，但它也有一些缺點(diǎn)： 只有一小部分細(xì)胞在監(jiān)控范圍，很多細(xì)胞的變化都檢

4、測不到。1. ECIS系統(tǒng)只有八個(gè)檢測培養(yǎng)皿孔卻有很大面積的參考電極，這對未來規(guī)?；l(fā)展不利。 下面要介紹一種real time cell electronic sensing (RT-CES) 實(shí)時(shí)細(xì)胞電子傳感技術(shù)，它用于觀測細(xì)胞增殖、毒性、成長抑制、凋亡等生物實(shí)驗(yàn)。因?yàn)樾滦碗姌O設(shè)計(jì)，它幾乎可以觀察培養(yǎng)皿孔中全部細(xì)胞的動態(tài)，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加具有一致性和可重復(fù)性。 和傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，兩者幾乎相同，但RT-CES展示了細(xì)胞在藥物作用下的動態(tài)變化，還可以一次性進(jìn)行更加細(xì)致的實(shí)驗(yàn)。Materials and Methods 三大構(gòu)成：電子傳感器分析儀，裝備站，16孔培養(yǎng)皿板circle-on-lin

5、e電極排列玻璃面的處理增加細(xì)胞在培養(yǎng)皿孔上的粘附強(qiáng)度培養(yǎng)皿板在裝備站上，裝備站通過電線連接電子傳感分析儀，在RT-CES軟件的操作下記錄和處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 16孔培養(yǎng)皿板的底部微電極陣列。每個(gè)檢測區(qū)域的面積是19.6平方毫米檢測區(qū)域的直徑是5毫米,外部用于測量阻抗的電子傳感器分析儀電極用的是10-mV交流電壓。 左邊是裸電極等效電路，包括電解質(zhì)電阻溶液的電阻和溶液/電極界面的阻抗。 右邊是細(xì)胞粘附后的電極等效電路，細(xì)胞等效為電容和電阻的并聯(lián)。 所有細(xì)胞：濕潤的保溫箱，37C, 5% CO2，10%胎兒牛血清，100 g/ml盤尼西寧/100 units/ml鏈霉素U2OS人骨肉瘤細(xì)胞：McCoy

6、媒介加左旋谷酰胺A2780人卵巢癌細(xì)胞：RPMI加10 g/ml胰島素LTK鼠成纖維細(xì)胞：2 mM谷氨酸鹽，1 mg/ml G418（抗生素），10 nM地塞米松（抗炎藥），地塞米松受體的抑制劑細(xì)胞先在室溫下培養(yǎng)15分鐘再放入RT-CES恒溫箱 微孔板熒光檢測儀組織培養(yǎng)皿鹽酸阿霉素紫杉醇 用Prism軟件（GraphPad Prism 是一數(shù)據(jù)分析和作圖軟件, 帶有基本的生物數(shù)理統(tǒng)計(jì), 曲線擬合, 及圖表顯示等功能, 適用于生物數(shù)理統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理 ）進(jìn)行數(shù)據(jù)的非線性回歸分析。Results and Discussion 在沒有細(xì)胞時(shí)，可以檢測到一個(gè)初始阻值；一個(gè)細(xì)胞貼附到電極表面，阻斷了部

7、分電路中通過的電流, 導(dǎo)致電極阻抗的增加；多個(gè)細(xì)胞附著在電極表面,進(jìn)一步減少電流,導(dǎo)致多重增加阻抗。 隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞在電極上增殖，大量的細(xì)胞貼附上電極,使得細(xì)胞可以相互連接得更緊密、分布到更遠(yuǎn)，從而使的電極阻抗快速增加。 一個(gè)參數(shù)稱為細(xì)胞指數(shù)(CI)派生的代表基于電阻抗測量細(xì)胞狀態(tài)N=3 for 10 kHz, 25 kHz and 50 kHz；R0(f ) and Rcell(f )分別表示沒有細(xì)胞或有細(xì)胞時(shí)的測量阻值。幾個(gè)特征：1、如果沒有細(xì)胞或細(xì)胞沒有貼附在電極上，CI=0；2、在相同條件下，細(xì)胞貼附得越多，CI值越大；3、細(xì)胞貼附數(shù)量一定時(shí)，改變細(xì)胞的狀態(tài)可以引起CI值的改變。

8、 A圖是傳統(tǒng)標(biāo)記測量技術(shù)和RT-CES技術(shù)對細(xì)胞活性的影響對比。接種后72h的結(jié)果。B圖是對比細(xì)胞增長速度，在接種5000cells/well后24h,48h,72h的測量結(jié)果。C圖是比較在細(xì)胞融合和過融合狀態(tài)下兩種測量方法。接種10000cells/well白色代表RT-CES技術(shù)。 40000cells/well，24h后添加一號化合物對誘導(dǎo)細(xì)胞的影響1 微M (red square)0.3 微M (green triangle)0.1 M微 (blue circle)0.03微M (pink X)0.01微M (orange open square)no compound (black

9、)B圖表示在24 (方塊), 36 (三角), and48 (圓) h后加入一號化合物的計(jì)量反應(yīng)曲線。C圖表示72h后一號化合物和二號化合物在兩種測量方法下的測量結(jié)果。白色表示RT-CES技術(shù)。 A圖是24 (方塊), 36 (圓), 48 (三角), and 60 (X) h之后加入紫杉酚對U2OS cells的影響。B圖是24 (方塊), 36 (圓), 48 (三角), and 60 (X) h之后加入三號化合物對U2OS cells的影響。C圖是用兩種方法觀察72h后三號化合物對細(xì)胞的有絲分裂阻斷活動。白色代表RT-CES A圖是24 (方塊), 36 (圓), 48 (三角), and 60 (X) h之后加入阿霉素對A2780 cells的影響。B圖是24h后添加化合物對細(xì)胞的影響300 nM (red triangle), 100 nM (green circle), 30 nM(blue cross), 3 nM (purple open square), 1 nM (orange opencircle), no compound (black )C圖是72h后四號化合物對A2780細(xì)胞凋亡的影響，用兩種測量方法。白色的是-CES技術(shù)。Conclusion 基于電阻抗測量的RT-CES系統(tǒng)對于細(xì)胞檢驗(yàn)來說是一個(gè)無標(biāo)記和簡單同一的操作。 RT-CES