1、l DNADNA復(fù)制的基本特點(diǎn)復(fù)制的基本特點(diǎn)l 參與參與DNADNA復(fù)制的有關(guān)物質(zhì)復(fù)制的有關(guān)物質(zhì) l DNADNA聚合酶聚合酶(DNA Polymerase)(DNA Polymerase)l DNADNA連接酶連接酶(DNA ligase(DNA ligase ) ) l DNADNA復(fù)制的過(guò)程復(fù)制的過(guò)程l DNADNA復(fù)制的真實(shí)性復(fù)制的真實(shí)性l 滾環(huán)滾環(huán)(Rolling circle)(Rolling circle)復(fù)制復(fù)制l DD環(huán)環(huán)(D-loop)(D-loop)復(fù)制復(fù)制l 不需要不需要RNARNA引物的引物的DNADNA復(fù)制復(fù)制lDNADNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的是由四種脫氧核

2、糖核酸所組成的長(zhǎng)鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。長(zhǎng)鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。l生物體的遺傳信息就貯存在生物體的遺傳信息就貯存在DNADNA的四的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。種脫氧核糖核酸的排列順序中。 l DNADNA通過(guò)復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過(guò)復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNADNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程就構(gòu)成了錄和翻譯過(guò)程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的中心法則遺傳學(xué)的中心法則。 l 在在RNARNA病毒中，其遺傳信息貯存在病毒中，其遺傳信息貯存

3、在RNARNA分子中。分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是RNARNA通過(guò)復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過(guò)復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNADNA，再由，再由DNADNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就稱為信息的流向就稱為反中心法則反中心法則。 DNA dependent DNA polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDR

4、PRNA dependent DNA polymeraseRDDP 復(fù)制（復(fù)制（DDDPDDDP） 轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄（DDRPDDRP） 翻譯翻譯 DNA RNA DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄（RDDPRDDP） RNA RNA 復(fù)制（復(fù)制（RDRPRDRP） 特點(diǎn)一、半保留復(fù)制特點(diǎn)一、半保留復(fù)制 lDNADNA在復(fù)制時(shí)，以親代在復(fù)制時(shí)，以親代DNADNA的每一條單鏈的每一條單鏈作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNADNA，每個(gè)子代，每個(gè)子代DNADNA中都含有一股親代中都含有一股親代DNADNA鏈，這種現(xiàn)象稱為鏈，這種現(xiàn)象稱為DNADNA的半保留

5、復(fù)制的半保留復(fù)制(semi-conservative replication)(semi-conservative replication)。 先將大腸桿菌放在先將大腸桿菌放在1515NHNH4 4C1C1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1515代，代，使幾乎所有的使幾乎所有的DNADNA都被都被1515N N標(biāo)記后，再將細(xì)菌移到只標(biāo)記后，再將細(xì)菌移到只含有含有1414NHNH4 4C1C1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后，在不同的時(shí)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后，在不同的時(shí)間取出樣品，用十二烷硫酸鈉間取出樣品，用十二烷硫酸鈉(SDS)(SDS)裂解細(xì)胞后，將裂解細(xì)胞后，將裂 解 液 放 在裂 解 液 放 在 C s C

6、1C s C 1 溶 液 中 進(jìn) 行 密 度 梯 度 離 心溶 液 中 進(jìn) 行 密 度 梯 度 離 心(140000g(140000g，2020小時(shí)小時(shí)) )。離心結(jié)束后，從管底到管口，。離心結(jié)束后，從管底到管口，溶液密度分布從高到低形成密度梯度。溶液密度分布從高到低形成密度梯度。DNADNA分子就分子就停留在與其相當(dāng)?shù)耐Ａ粼谂c其相當(dāng)?shù)腃sC1CsC1密度處，在紫外光下可以看密度處，在紫外光下可以看到形成的區(qū)帶。到形成的區(qū)帶。實(shí)驗(yàn)方案：實(shí)驗(yàn)方案： 1414N-DNAN-DNA分子密度較輕分子密度較輕(1.7g/cm3)(1.7g/cm3)，停留在離，停留在離管口較近的位置管口較近的位置; ;

7、1515N-DNAN-DNA密度較大停留在較低的位密度較大停留在較低的位置上。當(dāng)含有置上。當(dāng)含有1515N-DNAN-DNA的細(xì)胞在的細(xì)胞在1414NHNH4 4C1C1培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中培養(yǎng)一代后，只有一條區(qū)帶介于培養(yǎng)一代后，只有一條區(qū)帶介于1414N-DNAN-DNA與與1515N-N-DNADNA之間，這時(shí)在之間，這時(shí)在1515N-DNAN-DNA區(qū)已沒(méi)有吸收帶，說(shuō)明區(qū)已沒(méi)有吸收帶，說(shuō)明這時(shí)的這時(shí)的DNADNA一條鏈來(lái)自一條鏈來(lái)自1515N-DNAN-DNA，另一條鏈為新合，另一條鏈為新合成的含有成的含有1414N N的新鏈。培養(yǎng)兩代后則在的新鏈。培養(yǎng)兩代后則在1414N-DNAN-DNA

8、區(qū)又區(qū)又出現(xiàn)一條帶。在出現(xiàn)一條帶。在1414NHNH4 4C1C1中培養(yǎng)的時(shí)間愈久，中培養(yǎng)的時(shí)間愈久，1414N-N-DNADNA區(qū)帶愈強(qiáng)，而區(qū)帶愈強(qiáng)，而1414N-N-1515N-DNAN-DNA區(qū)帶逐漸減弱，但區(qū)帶逐漸減弱，但始終未出現(xiàn)其他新的區(qū)帶。按照半保留復(fù)制方式培養(yǎng)始終未出現(xiàn)其他新的區(qū)帶。按照半保留復(fù)制方式培養(yǎng)兩代，只能出現(xiàn)兩代，只能出現(xiàn)1414N-N-1515NDNANDNA兩種分子，而且隨著代兩種分子，而且隨著代數(shù)的增加數(shù)的增加1414N-DNAN-DNA逐漸增加。逐漸增加。MeselsonMeselson和和StahlStahl的的實(shí)驗(yàn)完全證實(shí)了保留復(fù)制的設(shè)想。實(shí)驗(yàn)完全證實(shí)了保

9、留復(fù)制的設(shè)想。 DNADNA的半保留復(fù)制表明的半保留復(fù)制表明DNADNA在代謝上的穩(wěn)定在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。特點(diǎn)二、有一定的復(fù)制起始點(diǎn)特點(diǎn)二、有一定的復(fù)制起始點(diǎn) DNADNA復(fù)制在生物細(xì)胞中要從復(fù)制在生物細(xì)胞中要從DNADNA分子上特定分子上特定位置開(kāi)始。這個(gè)特定的位置就稱為復(fù)制起點(diǎn)位置開(kāi)始。這個(gè)特定的位置就稱為復(fù)制起點(diǎn)(Origin of replication)(Origin of replication)，用，用oriori表示。表示。 DNADNA復(fù)制從起點(diǎn)開(kāi)始雙向進(jìn)行直到終點(diǎn)為止，復(fù)制從起點(diǎn)開(kāi)始雙向進(jìn)行直到終點(diǎn)為

10、止，每一個(gè)這樣的每一個(gè)這樣的DNADNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元元(replicon(replicon) )。 在原核生物中，每個(gè)在原核生物中，每個(gè)DNADNA分子上就有一個(gè)復(fù)分子上就有一個(gè)復(fù)制子；而在真核生物中，每個(gè)制子；而在真核生物中，每個(gè)DNADNA分子有許分子有許多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)約多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)約50-200kb50-200kb。因。因此，真核細(xì)胞此，真核細(xì)胞DNADNA的復(fù)制是由許多個(gè)復(fù)制子的復(fù)制是由許多個(gè)復(fù)制子共同完成的。共同完成的。 DNADNA復(fù)制不是隨機(jī)的從復(fù)制不是隨機(jī)的從DNADNA分子上的任何一點(diǎn)起分子上的任何一點(diǎn)起始，而是從特定的

11、區(qū)域開(kāi)始，這說(shuō)明復(fù)制起點(diǎn)有其結(jié)始，而是從特定的區(qū)域開(kāi)始，這說(shuō)明復(fù)制起點(diǎn)有其結(jié)構(gòu)上的特殊性。構(gòu)上的特殊性。 利用分子克隆技術(shù)，分離出利用分子克隆技術(shù)，分離出E.coliE.coli染色體染色體DNADNA復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)oriCoriC, , 它由它由422bp422bp組成。組成。 E.coli染色體染色體DNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為：(1) (1) 在在oriCoriC區(qū)域內(nèi)有一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，區(qū)域內(nèi)有一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，與復(fù)制酶系統(tǒng)的識(shí)別有關(guān)；與復(fù)制酶系統(tǒng)的識(shí)別有關(guān)；(2) (2) 在在oriCoriC區(qū)中還有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)區(qū)中還有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)( (啟動(dòng)子啟動(dòng)子)

12、)的序列，的序列，這暗示了轉(zhuǎn)錄可能在大腸桿菌染色體這暗示了轉(zhuǎn)錄可能在大腸桿菌染色體DNADNA復(fù)制起始中復(fù)制起始中起著重要的作用。目前已有許多實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄確實(shí)是起著重要的作用。目前已有許多實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄確實(shí)是復(fù)制的起始所必需的，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。復(fù)制的起始所必需的，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。 近年來(lái)，沙門(mén)氏桿菌近年來(lái)，沙門(mén)氏桿菌(Salmonellatypbimurinm(Salmonellatypbimurinm) )，產(chǎn)氣腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌(Erterobacteraerogers(Erterobacteraerogers) )，肺炎克氏桿菌，肺炎克氏桿菌(Klebsiellapne

13、umnonia(Klebsiellapneumnonia) )等許多細(xì)菌的等許多細(xì)菌的oriori區(qū)區(qū)被克隆，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相似，在核苷酸序被克隆，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相似，在核苷酸序列上有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?，而且在分?lèi)關(guān)系上愈是列上有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?，而且在分?lèi)關(guān)系上愈是接近的細(xì)菌之間其同源性愈高，這些反映了接近的細(xì)菌之間其同源性愈高，這些反映了DNADNA復(fù)制起點(diǎn)的重要性。復(fù)制起點(diǎn)的重要性。 特點(diǎn)三、需要引物特點(diǎn)三、需要引物 l 參與參與DNADNA復(fù)制的復(fù)制的DNADNA聚合酶，必須以一段具聚合酶，必須以一段具有有33端自由羥基（端自由羥基（3-OH3-OH）的）的RNARNA作為引作為引物物(pr

14、imer) (primer) ，才能開(kāi)始聚合子代，才能開(kāi)始聚合子代DNADNA鏈。鏈。l RNARNA引物的大小，在原核生物中通常為引物的大小，在原核生物中通常為5050100100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為1010個(gè)核苷個(gè)核苷酸。酸。RNARNA引物的堿基順序，與其模板引物的堿基順序，與其模板DNADNA的的堿基順序相配對(duì)。堿基順序相配對(duì)。 特點(diǎn)四、雙向復(fù)制特點(diǎn)四、雙向復(fù)制 DNADNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。單向復(fù)制（

15、如滾環(huán)復(fù)制）。 特點(diǎn)五、半不連續(xù)復(fù)制特點(diǎn)五、半不連續(xù)復(fù)制l 由于由于DNADNA聚合酶只能以聚合酶只能以5353方向聚合方向聚合子子代代DNADNA鏈鏈，即，即模板模板DNADNA鏈鏈的方向必須為的方向必須為3535。因此，分別以兩條親代。因此，分別以兩條親代DNADNA鏈作鏈作為模板聚合子代為模板聚合子代DNADNA鏈時(shí)的方式是不同的。鏈時(shí)的方式是不同的。l 以以3535方向的親代方向的親代DNADNA鏈作模板的子代鏈鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)橄驗(yàn)?353，這一條，這一條鏈被稱為鏈被稱為前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leadi

16、ng (leading strand)strand)。而以。而以5353方向的親代方向的親代DNADNA鏈為模鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是向也是5353，這條，這條鏈被稱為鏈被稱為后隨鏈后隨鏈(lagging (lagging strand)strand)。l 由于親代由于親代DNADNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開(kāi)的，因雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開(kāi)的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNADNA在復(fù)在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNADNA短鏈稱短鏈稱為為岡崎片段岡

17、崎片段(Okazaki fragment)(Okazaki fragment)。l 岡崎片段的大小，在原核生物中約為岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000100020002000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100100個(gè)核個(gè)核苷酸。苷酸。 一、底物（一、底物（DNADNA復(fù)制的原料）復(fù)制的原料） 以四種脫氧核糖核苷酸以四種脫氧核糖核苷酸(deoxynucleotide triphosphate(deoxynucleotide triphosphate) )為底為底物，即物，即dATPdATP，dGTPdGTP，dCTPdCTP，dTTPdTTP。 (dNMP)(d

18、NMP)n n+dNTP+dNTP (dNMP) (dNMP)n+1n+1+PPi+PPi 二、模板二、模板(template)(template)l DNADNA復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代DNADNA鏈作為模板。親代鏈作為模板。親代DNADNA的兩股鏈解開(kāi)的兩股鏈解開(kāi)后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。 DNADNA復(fù)制涉及到的第一個(gè)問(wèn)題就是復(fù)制涉及到的第一個(gè)問(wèn)題就是DNADNA兩條鏈兩條鏈要在復(fù)制叉的位置解開(kāi)。要在復(fù)制叉的位置解開(kāi)。 細(xì)胞內(nèi)的解鏈酶在復(fù)制叉處打開(kāi)雙鏈。解鏈酶細(xì)胞內(nèi)的解鏈酶在復(fù)制叉處打開(kāi)雙鏈。解鏈酶和單鏈和單鏈DNAD

19、NA結(jié)合，利用結(jié)合，利用ATPATP分解產(chǎn)生的能量沿分解產(chǎn)生的能量沿DNADNA鏈鏈向前運(yùn)動(dòng)促使向前運(yùn)動(dòng)促使DNADNA雙鏈打開(kāi)。雙鏈打開(kāi)。 E.coliE.coli中有兩種解鏈酶參與這個(gè)過(guò)程，一種為解中有兩種解鏈酶參與這個(gè)過(guò)程，一種為解鏈酶鏈酶或解鏈酶或解鏈酶，與滯后鏈的模板，與滯后鏈的模板DNADNA結(jié)合沿結(jié)合沿5353方向運(yùn)動(dòng)；第二種為方向運(yùn)動(dòng)；第二種為RepRep蛋白，和前導(dǎo)鏈的蛋白，和前導(dǎo)鏈的模板模板DNADNA結(jié)合沿結(jié)合沿3535方向運(yùn)動(dòng)。方向運(yùn)動(dòng)。 l 解螺旋酶解螺旋酶（unwinding unwinding enzymeenzyme） ，又，又稱解鏈酶或稱解鏈酶或reprep蛋

20、蛋白，是用于解開(kāi)白，是用于解開(kāi)DNADNA雙鏈的酶蛋雙鏈的酶蛋白，每解開(kāi)一對(duì)白，每解開(kāi)一對(duì)堿基，需消耗兩堿基，需消耗兩分子分子ATPATP。目前發(fā)。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在現(xiàn)存在至少存在兩種解螺旋酶。兩種解螺旋酶。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶：它的作用是暫時(shí)切斷一條：它的作用是暫時(shí)切斷一條DNADNA鏈，形成鏈，形成酶酶-DNA-DNA共價(jià)中間物而使超螺旋共價(jià)中間物而使超螺旋DNADNA松弛化，然后再將松弛化，然后再將切斷的單鏈切斷的單鏈DNADNA連接起來(lái)，而不需要任何輔助因子。大連接起來(lái)，而不需要任何輔助因子。大腸桿菌的腸桿菌的 蛋白蛋白(MW110000)(MW110000)就是一種典型的拓?fù)洚悩?gòu)

21、就是一種典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶酶。拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶：能將負(fù)超螺旋引入：能將負(fù)超螺旋引入DNADNA分子，該酶能暫分子，該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNADNA，同時(shí)需要，同時(shí)需要ATPATP水解為水解為ADPADP以供能。大腸桿菌中的以供能。大腸桿菌中的DNADNA旋轉(zhuǎn)酶旋轉(zhuǎn)酶(DNA gyrase(DNA gyrase) )是是典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶。拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)l 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶可使可使DNADNA雙鏈中的一條鏈雙鏈中的一條鏈切斷，松開(kāi)雙螺旋后切斷，松開(kāi)雙螺旋后再將再將DNADNA鏈連接起來(lái)，鏈連接起來(lái)，從而避

22、免出現(xiàn)鏈的纏從而避免出現(xiàn)鏈的纏繞。繞。拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶可可切斷切斷DNADNA雙鏈，使雙鏈，使DNADNA的超螺旋松解后，的超螺旋松解后，再將其連接起來(lái)。再將其連接起來(lái)。大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)(a) (a) 酶與酶與DNADNA結(jié)合使雙鏈解旋結(jié)合使雙鏈解旋; ;(b) (b) 使一條鏈切開(kāi)，但酶與切口的兩端結(jié)合使一條鏈切開(kāi)，但酶與切口的兩端結(jié)合 阻止了螺旋的旋轉(zhuǎn)阻止了螺旋的旋轉(zhuǎn); ;(c) (c) 酶使另一條鏈經(jīng)過(guò)缺口，然后再將兩斷酶使另一條鏈經(jīng)過(guò)缺口，然后再將兩斷 端連接起來(lái)端連接起來(lái); ;(d) (d) 酶從酶從DNADNA上脫落，兩條鏈復(fù)原，得到的上脫落，兩

23、條鏈復(fù)原，得到的 DNADNA比原來(lái)少一個(gè)負(fù)性超螺旋。比原來(lái)少一個(gè)負(fù)性超螺旋。幾乎所有天然狀態(tài)的雙鏈幾乎所有天然狀態(tài)的雙鏈DNADNA均以負(fù)超螺旋的均以負(fù)超螺旋的方式存在，特別是進(jìn)行半保留復(fù)制的方式存在，特別是進(jìn)行半保留復(fù)制的DNADNA均以這種均以這種拓?fù)洚悩?gòu)體的形式存在。許多實(shí)驗(yàn)證明，負(fù)超螺旋拓?fù)洚悩?gòu)體的形式存在。許多實(shí)驗(yàn)證明，負(fù)超螺旋是是DNADNA復(fù)制的必需條件，因此復(fù)制的必需條件，因此DNADNA旋轉(zhuǎn)酶也是復(fù)制旋轉(zhuǎn)酶也是復(fù)制所必要的。負(fù)超螺旋的存在可以使所必要的。負(fù)超螺旋的存在可以使DNADNA雙鏈堿基對(duì)雙鏈堿基對(duì)打開(kāi)所需要的能量降低打開(kāi)所需要的能量降低4.1KJ/mol4.1KJ/

24、mol，因而，有利于，因而，有利于DNADNA的雙鏈分開(kāi)。的雙鏈分開(kāi)。 許多許多DNADNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑，如萘啶酮酸，香豆旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑，如萘啶酮酸，香豆霉素和新生霉毒等均可以抑制大腸桿菌的霉素和新生霉毒等均可以抑制大腸桿菌的DNADNA復(fù)復(fù)制。制。 l 單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白（結(jié)合蛋白（single strand binding single strand binding protein, SSBprotein, SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDPHDP）。這）。這是一些能夠與單鏈?zhǔn)且恍┠軌蚺c單鏈DNADNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：用為：

25、使解開(kāi)雙螺旋后的使解開(kāi)雙螺旋后的DNADNA單鏈能夠穩(wěn)定存單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈在，即穩(wěn)定單鏈DNADNA，便于以其為模板復(fù)制子代，便于以其為模板復(fù)制子代DNADNA； 保護(hù)單鏈保護(hù)單鏈DNADNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。 SSBSSB與解鏈酶不一樣，它不具備酶的活性，與解鏈酶不一樣，它不具備酶的活性，不和不和ATPATP結(jié)合。在大腸桿菌細(xì)胞中主要結(jié)合。在大腸桿菌細(xì)胞中主要SSBSSB是是177177肽所組成的四聚體，可以和單鏈肽所組成的四聚體，可以和單鏈DNADNA上上3232個(gè)個(gè)核苷酸結(jié)合。核苷酸結(jié)合。 一個(gè)一個(gè)SSBSSB四聚體結(jié)合于單鏈四聚體結(jié)合于單鏈DNADNA

26、上可以促上可以促進(jìn)其他進(jìn)其他SSBSSB四聚體與相鄰的單鏈四聚體與相鄰的單鏈DNADNA結(jié)合，這個(gè)結(jié)合，這個(gè)過(guò)程稱為協(xié)同結(jié)合過(guò)程稱為協(xié)同結(jié)合(cooperative binding)(cooperative binding)。 SSBSSB結(jié)合到單鏈結(jié)合到單鏈DNADNA上后，使其呈伸展?fàn)钌虾螅蛊涑噬煺範(fàn)顟B(tài)，沒(méi)有彎曲和結(jié)節(jié)，有利于單鏈態(tài)，沒(méi)有彎曲和結(jié)節(jié)，有利于單鏈DNADNA作為模板。作為模板。SSBSSB可以重復(fù)使用，當(dāng)新生的可以重復(fù)使用，當(dāng)新生的DNADNA鏈合成到某一鏈合成到某一位置時(shí)，該處的位置時(shí)，該處的SSBSSB便會(huì)脫落，并被重復(fù)利用。便會(huì)脫落，并被重復(fù)利用。 大腸桿菌的引物酶也

27、是大腸桿菌的引物酶也是DNADNA復(fù)制所必需復(fù)制所必需的一種酶。該酶由一條多肽鏈組成，的一種酶。該酶由一條多肽鏈組成，MWMW為為60KD60KD，每個(gè)細(xì)胞中有，每個(gè)細(xì)胞中有50-10050-100個(gè)分子由大腸桿菌個(gè)分子由大腸桿菌的的dnaGdnaG基因編碼。引物酶催化引物基因編碼。引物酶催化引物RNARNA分子的分子的合成。合成。l 引發(fā)體引發(fā)體(primosome(primosome) )由引發(fā)前體與引物酶由引發(fā)前體與引物酶（primaseprimase）組裝而成。）組裝而成。l 引發(fā)前體是由若干蛋白因子聚合而成的復(fù)合體。引發(fā)前體是由若干蛋白因子聚合而成的復(fù)合體。在原核生物中，引發(fā)前體至少

28、由六種蛋白因子構(gòu)在原核生物中，引發(fā)前體至少由六種蛋白因子構(gòu)成。蛋白成。蛋白i i、蛋白、蛋白n n、蛋白、蛋白n”n”、蛋白、蛋白dnaCdnaC與引與引物預(yù)合成有關(guān)，蛋白物預(yù)合成有關(guān)，蛋白nn與蛋白與蛋白dnaBdnaB與識(shí)別復(fù)與識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)有關(guān)，并具有制起始點(diǎn)有關(guān)，并具有ATPaseATPase活性?；钚浴 引物酶本質(zhì)上是一種依賴引物酶本質(zhì)上是一種依賴DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶（DDRPDDRP），該酶以），該酶以DNADNA為模板，聚合一段為模板，聚合一段RNARNA短鏈引物短鏈引物(primer)(primer)，以提供自由的，以提供自由的3-OH3-OH，使子代使子

29、代DNADNA鏈能夠開(kāi)始聚合。鏈能夠開(kāi)始聚合。 引物酶和傳統(tǒng)的引物酶和傳統(tǒng)的RNA聚合酶的區(qū)別：聚合酶的區(qū)別：11引物酶對(duì)雷米封不敏感，引物酶對(duì)雷米封不敏感，RNARNA聚合酶則敏感；聚合酶則敏感；22引物酶既可利用核糖核苷酸，也利用脫氧核糖核苷酸，引物酶既可利用核糖核苷酸，也利用脫氧核糖核苷酸，而而RNARNA聚合酶只能利用核糖核苷酸；聚合酶只能利用核糖核苷酸；33引物酶只在復(fù)制起點(diǎn)處合成引物酶只在復(fù)制起點(diǎn)處合成RNARNA引物而引發(fā)引物而引發(fā)DNADNA的復(fù)的復(fù)制，而制，而RNARNA聚合酶則是啟動(dòng)聚合酶則是啟動(dòng)DNADNA轉(zhuǎn)錄合成轉(zhuǎn)錄合成RNARNA從而將遺從而將遺傳信息由傳信息由DNA

30、DNA傳遞到傳遞到RNARNA。 但在單鏈?zhǔn)删w但在單鏈?zhǔn)删wM13DNAM13DNA和質(zhì)粒和質(zhì)粒Co1E1DNACo1E1DNA復(fù)制時(shí)，引物的合成是由復(fù)制時(shí)，引物的合成是由RNARNA聚合酶催化的。聚合酶催化的。噬菌體噬菌體T7T7的的Gene4Gene4蛋白，蛋白，T4T4的的Gene41Gene41和和6161蛋白等也具有引物酶的活性和具有大腸桿菌引蛋白等也具有引物酶的活性和具有大腸桿菌引物酶相似的功能。物酶相似的功能。lDNADNA的合成需要一段的合成需要一段RNARNA鏈作為引物，鏈作為引物，l以以DNADNA為模板由引物酶催化合成為模板由引物酶催化合成 此酶最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，以

31、后陸續(xù)在其他原此酶最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，以后陸續(xù)在其他原核生物及微生物中找到。核生物及微生物中找到。這類(lèi)酶的共同性質(zhì)是：這類(lèi)酶的共同性質(zhì)是：11以以dNTPdNTP為前體催化合成為前體催化合成DNADNA；22需要模板和引物的存在；需要模板和引物的存在；33不能起始合成新的不能起始合成新的DNADNA鏈；鏈；44催化催化dNTPdNTP加到生長(zhǎng)中的加到生長(zhǎng)中的DNADNA鏈的鏈的3-OH3-OH末端；末端；55催化催化DNADNA合成的方向是合成的方向是5353。種類(lèi)種類(lèi)l 在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNADNA聚合酶有三種：聚合酶有三種： DNADNA聚合酶聚合酶（po

32、lpol ），）， DNADNA聚合酶聚合酶（polpol ），）， DNADNA聚合酶聚合酶（polpol ），），l 這三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。這三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與參與DNADNA復(fù)制的主要是復(fù)制的主要是pol pol 和和polpol 。 (1)(1)理化性質(zhì)：理化性質(zhì)：純化的純化的DNA polDNA pol由一條多肽鏈組成，由一條多肽鏈組成，約含約含10001000個(gè)氨基酸殘基，個(gè)氨基酸殘基，MWMW為為109KD109KD。分子含。分子含有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)-SH-SH基。通過(guò)二個(gè)酶分子上的基。通過(guò)二個(gè)酶分子上的- -SHSH基

33、與基與HgHg2+2+結(jié)合產(chǎn)生二聚體，仍有活性。每個(gè)酶結(jié)合產(chǎn)生二聚體，仍有活性。每個(gè)酶分子中含有一個(gè)分子中含有一個(gè)ZnZn2+2+，在，在DNADNA聚合反應(yīng)起著很重要聚合反應(yīng)起著很重要的作用。每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中含有約的作用。每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中含有約400400個(gè)分子，個(gè)分子，每個(gè)分子每分鐘在每個(gè)分子每分鐘在3737下能催化下能催化667667個(gè)核苷酸摻入個(gè)核苷酸摻入正在生長(zhǎng)的正在生長(zhǎng)的DNADNA鏈。鏈。DNA polDNA pol在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約65A65A。在酶的縱。在酶的縱軸上有一個(gè)約軸上有一個(gè)約20A20A的深溝的深溝(cleft)(cleft

34、)，帶有正電荷，這是該酶的活性中，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有心位置，在此位置上至少有6 6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)個(gè)結(jié)合位點(diǎn): :1 1 模板模板DNADNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn); ;2 DNA2 DNA生長(zhǎng)鏈或引物結(jié)合位點(diǎn)生長(zhǎng)鏈或引物結(jié)合位點(diǎn); ;3 3 引物末端結(jié)合位點(diǎn)，用以專(zhuān)一引物或引物末端結(jié)合位點(diǎn)，用以專(zhuān)一引物或DNADNA生長(zhǎng)鏈的生長(zhǎng)鏈的3-OH;3-OH;4 4 脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn)脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn); ;5 535 53外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合生長(zhǎng)鏈前方的外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合生長(zhǎng)鏈前方的5-5-端脫端脫氧核苷酸并切除之氧核苷酸并切除之; ;6 356 35外切酶

35、活性位點(diǎn)，用以結(jié)合和切除生長(zhǎng)鏈上未配對(duì)的外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合和切除生長(zhǎng)鏈上未配對(duì)的3-3-端核苷酸。端核苷酸。功能功能1聚合作用聚合作用：在引物在引物RNA3-OHRNA3-OH末端，以末端，以dNTPdNTP為底物，按模板為底物，按模板DNADNA上的指令由上的指令由DNA polDNA pol逐個(gè)將核苷酸加上去，逐個(gè)將核苷酸加上去，就是就是DNA polDNA pol的聚合作用。酶的專(zhuān)一性主要表現(xiàn)的聚合作用。酶的專(zhuān)一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNADNA配對(duì)時(shí)才有配對(duì)時(shí)才有催化作用。催化作用。dNTPdNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)進(jìn)入結(jié)

36、合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)象發(fā)生變化，促進(jìn)3-OH3-OH與與5-PO5-PO4 4結(jié)合生成磷酸二結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被3-53-5外切酶活性外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除之。位點(diǎn)所識(shí)別并切除之。2 35外切酶活性外切酶活性校對(duì)作用校對(duì)作用：這種酶活性的主要功能是從這種酶活性的主要功能是從3355方向識(shí)別和切除方向識(shí)別和切除不配對(duì)的不配對(duì)的DNADNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒(méi)有反應(yīng)底物沒(méi)有反應(yīng)底物dNTPd

37、NTP時(shí)，由于沒(méi)有聚合作用而出現(xiàn)時(shí)，由于沒(méi)有聚合作用而出現(xiàn)暫時(shí)的游離現(xiàn)象，從而被暫時(shí)的游離現(xiàn)象，從而被3535外切酶活性所降解。外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進(jìn)這種作用，這表如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進(jìn)這種作用，這表明溫度升高使明溫度升高使DNADNA生長(zhǎng)鏈生長(zhǎng)鏈33末端與模板發(fā)生分離的末端與模板發(fā)生分離的機(jī)會(huì)更多，因而降解作用加強(qiáng)。當(dāng)向反應(yīng)體系加入機(jī)會(huì)更多，因而降解作用加強(qiáng)。當(dāng)向反應(yīng)體系加入dNTPdNTP，而且只加放與模板互補(bǔ)的上述核苷酸才會(huì)，而且只加放與模板互補(bǔ)的上述核苷酸才會(huì)使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進(jìn)行使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進(jìn)行DNADNA的合的合成

38、。成。3 53外切酶活性外切酶活性切除修復(fù)作用切除修復(fù)作用：5353外切酶活性就是從外切酶活性就是從5533方向水解方向水解DNADNA生長(zhǎng)生長(zhǎng)鏈前方的鏈前方的DNADNA鏈，主要產(chǎn)生鏈，主要產(chǎn)生5-5-脫氧核苷酸。這種脫氧核苷酸。這種酶活性只對(duì)酶活性只對(duì)DNADNA上配對(duì)部份上配對(duì)部份( (雙鏈雙鏈) )磷酸二酯鍵有切磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是割活力作用，方向是5353。每次能切除。每次能切除1010個(gè)核苷個(gè)核苷酸，而且酸，而且DNADNA的聚合作用能刺激的聚合作用能刺激5353外切酶活力外切酶活力達(dá)達(dá)1010倍以上。因此，這種酶活性在倍以上。因此，這種酶活性在DNADNA損傷的修損傷

39、的修復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段55末端末端DNADNA引引物的去除依賴此種外切酶活性。物的去除依賴此種外切酶活性。DNA聚合酶聚合酶35和和53外切酶活性比較外切酶活性比較特性特性3553底物末端底物末端非常特異非常特異:只識(shí)只識(shí)別別 D - 核 糖 的核 糖 的3-OH特異性不高特異性不高:DNA或或RNA中配中配對(duì)的或錯(cuò)配的堿基均可，對(duì)的或錯(cuò)配的堿基均可，5端帶有端帶有- O H 或 帶 有 一 磷 酸 、 二 磷或 帶 有 一 磷 酸 、 二 磷酸、三磷酸酸、三磷酸二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)單 鏈 或 雙 鏈單 鏈 或 雙 鏈DNA中不配對(duì)中不配對(duì)的末端的末端

40、雙鏈雙鏈DNA的配對(duì)堿基末端的配對(duì)堿基末端產(chǎn)物產(chǎn)物只有只有5-單核苷酸單核苷酸5-單核苷酸占單核苷酸占80%，寡核苷，寡核苷酸酸20%內(nèi)切酶作用內(nèi)切酶作用無(wú)無(wú)可切割從末端起可切割從末端起8-100個(gè)核苷個(gè)核苷酸處的二酯鍵酸處的二酯鍵聚 合 作 用 對(duì) 其聚 合 作 用 對(duì) 其活性的影響活性的影響完全抑制完全抑制可 提 高 活 性可 提 高 活 性 1 0 倍 ， 而 且 寡 核倍 ， 而 且 寡 核苷酸產(chǎn)物增多苷酸產(chǎn)物增多作用作用復(fù)制校正復(fù)制校正缺 口 平 移 ， 切 去缺 口 平 移 ， 切 去 D N A 末 端 的末 端 的RNA引物引物4焦磷酸解作用：DNA pol的這種活性可以催化3

41、末端焦磷酸解DNA分子。其作用就是無(wú)機(jī)焦磷酸分解DNA生長(zhǎng)鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。5焦磷酸交換作用：催化dNTP末端的PPi同無(wú)機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為：32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒(méi)有足夠高的PPi而無(wú)重要意義。 DNADNA聚合酶聚合酶缺陷的突變株仍能生存，這表缺陷的突變株仍能生存，這表明明DNA polDNA pol不是不是DNADNA復(fù)制的主要聚合酶。人們開(kāi)復(fù)制的主要聚合酶。人們開(kāi)始尋找另外的始尋找另外的DNADNA聚合酶，并于聚合酶，

42、并于19701970年發(fā)現(xiàn)了年發(fā)現(xiàn)了DNA polDNA pol。此酶。此酶MWMW為為120KD120KD，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)約有，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)約有100100個(gè)酶分子，但活性只有個(gè)酶分子，但活性只有DNA polDNA pol的的5%5%。 (1)聚合作用聚合作用： 催化催化DNADNA的聚合，但是對(duì)模板有特殊的要求的聚合，但是對(duì)模板有特殊的要求 最適模板：雙鏈最適模板：雙鏈DNADNA而中間有空隙而中間有空隙(gap)(gap)的單鏈的單鏈DNADNA部份，而且該單鏈空隙部份不長(zhǎng)于部份，而且該單鏈空隙部份不長(zhǎng)于100100個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。 備注：備注：對(duì)于較長(zhǎng)的單鏈對(duì)于較長(zhǎng)的單鏈DNADNA模

43、板區(qū)該酶的聚合活模板區(qū)該酶的聚合活性很低。但是用單鏈結(jié)合蛋白性很低。但是用單鏈結(jié)合蛋白(SSB)(SSB)可以提高其聚合可以提高其聚合速率，可達(dá)原來(lái)的速率，可達(dá)原來(lái)的50-10050-100倍。倍。(2)(2)具有具有3535外切酶活性，但無(wú)外切酶活性，但無(wú)5353外切酶活性。外切酶活性。(3)(3)對(duì)作用底物的選擇性較強(qiáng)，一般只能將對(duì)作用底物的選擇性較強(qiáng)，一般只能將2-2-脫脫氧核苷酸摻入到氧核苷酸摻入到DNADNA鏈中。鏈中。(4)(4)不是復(fù)制的主要聚合酶，因?yàn)榇嗣溉毕莸拇蟛皇菑?fù)制的主要聚合酶，因?yàn)榇嗣溉毕莸拇竽c桿菌突變株的腸桿菌突變株的DNADNA復(fù)制都正常。可能在復(fù)制都正常。可能在D

44、NADNA的的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。 DNA polDNA pol 全酶由多種亞基組成全酶由多種亞基組成( (見(jiàn)下表見(jiàn)下表) )，而，而且容易分解。大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中只有且容易分解。大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中只有10-2010-20個(gè)酶?jìng)€(gè)酶分子，因此不易獲得純品，為研究該酶的各種性質(zhì)分子，因此不易獲得純品，為研究該酶的各種性質(zhì)和功能帶來(lái)了許多困難。和功能帶來(lái)了許多困難。 盡管該酶在細(xì)胞內(nèi)存在的數(shù)量較少，但催化脫氧盡管該酶在細(xì)胞內(nèi)存在的數(shù)量較少，但催化脫氧核苷酸摻入核苷酸摻入DNADNA鏈的速率分別是鏈的速率分別是DNADNA聚合酶聚合酶的的1515倍和倍和3030

45、倍。倍。 DNA polDNA pol的最適模板：雙鏈的最適模板：雙鏈DNADNA中間有空隙的中間有空隙的單鏈單鏈DNADNA，SSBSSB可以提高該酶催化單鏈可以提高該酶催化單鏈DNADNA模板模板的的DNADNA聚合作用。聚合作用。 DNA polDNA pol也有也有3535和和5353外切酶活性，但是外切酶活性，但是3535外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)峭馇忻富钚缘淖钸m底物是單鏈?zhǔn)荄NADNA，只產(chǎn)，只產(chǎn)生生5-5-單核苷酸，不會(huì)產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從單核苷酸，不會(huì)產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從33端開(kāi)始切除一個(gè)核苷酸。端開(kāi)始切除一個(gè)核苷酸。5353外切酶活性也要外切酶活性也要求有單鏈求

46、有單鏈DNADNA為起始作用底物，但一旦開(kāi)始后，便為起始作用底物，但一旦開(kāi)始后，便可作用于雙鏈區(qū)?？勺饔糜陔p鏈區(qū)。DNADNA聚合酶聚合酶的組成的組成亞基亞基分子量分子量(103)其它名稱其它名稱a140dnaE蛋白，蛋白，polC蛋白蛋白25108352dnaZ蛋白蛋白32dnaX蛋白蛋白40dnaN蛋白，蛋白，copoll polpol 由十種亞基組成，其中由十種亞基組成，其中 亞基具有亞基具有5353聚合聚合DNADNA的酶活性，因而具有復(fù)制的酶活性，因而具有復(fù)制DNADNA的功的功能；而能；而 亞基具有亞基具有3535外切酶的活性，因而與外切酶的活性，因而與DNADNA復(fù)制的校正功能有

47、關(guān)。復(fù)制的校正功能有關(guān)。 大腸桿菌三種大腸桿菌三種DNA聚合酶的特性聚合酶的特性功能功能polpolpol聚合作用聚合作用53+外切酶活性外切酶活性35+外切酶活性外切酶活性53+焦磷酸解和焦磷酸交換作用焦磷酸解和焦磷酸交換作用+-+模板及引物的選擇模板及引物的選擇完整的完整的DNA雙鏈雙鏈-帶引物的長(zhǎng)單鏈帶引物的長(zhǎng)單鏈DNA+-帶缺口的雙鏈帶缺口的雙鏈DNA+-雙鏈而有間障的雙鏈而有間障的DNA+一般性質(zhì)一般性質(zhì)分子量分子量109KD120KD140KD每細(xì)胞中的分子量每細(xì)胞中的分子量40017-10010-20結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因polApolBpolC性質(zhì) 聚合酶 聚合酶 聚合酶3 5 外切

48、活性+ + + +5 3 外切活性+-5 3 聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生鏈合成-+: 主要是對(duì)主要是對(duì)DNA損傷損傷的修復(fù)；以及的修復(fù)；以及在在DNA復(fù)復(fù)制時(shí)切除制時(shí)切除RNARNA引物并填引物并填補(bǔ)其留下的空隙。補(bǔ)其留下的空隙。：修復(fù)修復(fù)紫外光引起紫外光引起的的DNA損傷損傷 ：DNA 復(fù)制的復(fù)制的主要聚合酶，還具有主要聚合酶，還具有3-53-5外切酶的校外切酶的校對(duì)功能，提高對(duì)功能，提高DNA復(fù)復(fù)制的保真性制的保真性 近年來(lái)在枯草桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌等細(xì)胞近年來(lái)在枯草桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌等細(xì)胞及噬菌體及噬菌體T4T4、T5T5、T7T7中分離到中分離到DNADNA聚合酶。聚合酶

49、。 T4DNAT4DNA聚合酶與大腸桿菌聚合酶與大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶相似，也相似，也是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有它至少含有1515個(gè)半胱氨酸殘基。但是，它在作用上與個(gè)半胱氨酸殘基。但是，它在作用上與大腸桿菌大腸桿菌DNA polDNA pol不同：不同：11它無(wú)它無(wú)5353外切酶活性；外切酶活性；22它需要一條有引物的單鏈它需要一條有引物的單鏈DNADNA作模板。作模板。真核生物中真核生物中DNADNA聚合酶都沒(méi)有聚合酶都沒(méi)有3535或或5353外切酶活性。其聚合反應(yīng)機(jī)制與原核生物的聚合一外切酶活性。其聚合反

50、應(yīng)機(jī)制與原核生物的聚合一樣。樣。DNADNA聚合酶聚合酶 ：主要的酶：主要的酶( (占總量的占總量的80-90%)80-90%)，分子，分子量為量為300KD300KD，含有，含有4 4個(gè)或個(gè)或5 5個(gè)亞基，主要負(fù)責(zé)染色個(gè)亞基，主要負(fù)責(zé)染色體體DNADNA的復(fù)制。的復(fù)制。DNADNA聚合酶聚合酶 ：分子量為：分子量為45KD45KD，僅含有一條鏈，僅含有一條鏈，主要作用是修復(fù)核內(nèi)主要作用是修復(fù)核內(nèi)DNADNA。DNADNA聚合酶聚合酶 ：分子量為：分子量為140KD140KD，存在于線粒體內(nèi)，存在于線粒體內(nèi)，負(fù)責(zé)催化線粒體負(fù)責(zé)催化線粒體DNADNA的復(fù)制。的復(fù)制。DNADNA聚合酶聚合酶 ：從

51、兔的骨髓細(xì)胞質(zhì)中分離到一種：從兔的骨髓細(xì)胞質(zhì)中分離到一種DNADNA聚合酶，這種酶與上述真核生物的聚合酶，這種酶與上述真核生物的DNADNA聚合聚合酶不同，而與原核生物的聚合酶類(lèi)似，具有酶不同，而與原核生物的聚合酶類(lèi)似，具有3535核酸外切酶活性核酸外切酶活性。 另外，從酵母、原蟲(chóng)等低真核生物中分離到另外，從酵母、原蟲(chóng)等低真核生物中分離到一些一些DNADNA聚合酶。一般來(lái)說(shuō)，這些低等生物都沒(méi)有聚合酶。一般來(lái)說(shuō)，這些低等生物都沒(méi)有低分子量的低分子量的DNADNA聚合酶聚合酶 ，而且與原核生物的，而且與原核生物的DNADNA聚合酶相似，有聚合酶相似，有3535外切酶活性。外切酶活性。真核生物（真核

52、生物（DNA-pol）：）：l 與隨從鏈的合成有關(guān)l 核酸外切酶活性 與修復(fù)有關(guān)l 存在于線粒體l 與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)l 與校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口有關(guān) DNADNA連接酶是連接酶是19671967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉現(xiàn)的。它是一種封閉DNADNA鏈上缺口酶，借助鏈上缺口酶，借助ATPATP或或NADNAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNADNA鏈的鏈的5-PO5-PO4 4與另與另一一DNADNA鏈的鏈的3-OH3-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補(bǔ)鏈配對(duì)結(jié)合的必須是與同一條互補(bǔ)鏈配對(duì)結(jié)合的(T4DNA(T4D

53、NA連接酶連接酶除外除外) )，而且必須是兩條緊鄰，而且必須是兩條緊鄰DNADNA鏈才能被鏈才能被DNADNA連連接酶催化成磷酸二酯鍵。接酶催化成磷酸二酯鍵。l DNADNA連接酶（連接酶（19671967年發(fā)現(xiàn)）特性：年發(fā)現(xiàn)）特性： 若雙鏈若雙鏈DNADNA中一條鏈有切口，一端是中一條鏈有切口，一端是3-OH3-OH，另，另一端是一端是5-5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。酸二酯鍵，而使切口連接。l 但是它不能將兩條游離的但是它不能將兩條游離的DNADNA單鏈連接起來(lái)單鏈連接起來(lái)l DNADNA連接酶在連接酶在DNADNA復(fù)制、損傷修

54、復(fù)、重組等過(guò)復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過(guò)程中起重要作用程中起重要作用l DNADNA連接酶催化的條件是：連接酶催化的條件是：l 需一段需一段DNADNA片段具有片段具有3-OH3-OH，而另一段，而另一段DNADNA片段具有片段具有5-Pi5-Pi基；基；l 未封閉的缺口位于雙鏈未封閉的缺口位于雙鏈DNADNA中中，即其中有一條鏈，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾模皇峭暾?；l 需要消耗能量，在需要消耗能量，在原核原核生物中由生物中由NADNAD+ +供能供能，在，在真真核生物中由核生物中由ATPATP供能供能。以上只是敘述了有關(guān)以上只是敘述了有關(guān)DNADNA復(fù)制的幾個(gè)主要蛋白質(zhì)復(fù)制的幾個(gè)主要蛋白質(zhì)和酶。在

55、和酶。在DNADNA復(fù)制過(guò)程中還有許多蛋白質(zhì)參與，如大復(fù)制過(guò)程中還有許多蛋白質(zhì)參與，如大腸桿菌細(xì)胞中就有三十多種蛋白質(zhì)參與腸桿菌細(xì)胞中就有三十多種蛋白質(zhì)參與DNADNA復(fù)制，許復(fù)制，許多蛋白質(zhì)的功能目前還只是猜測(cè)，而且其各種特性尚多蛋白質(zhì)的功能目前還只是猜測(cè)，而且其各種特性尚不明了。不明了。DNADNA復(fù)制過(guò)程中還有許多未知的因子參與，復(fù)制過(guò)程中還有許多未知的因子參與，DNADNA復(fù)制過(guò)程中許多具體的細(xì)節(jié)尚不十分清楚。復(fù)制過(guò)程中許多具體的細(xì)節(jié)尚不十分清楚。l 雙鏈的解開(kāi)雙鏈的解開(kāi)l RNARNA引物的合成引物的合成l DNADNA鏈的延伸鏈的延伸l 切除切除RNARNA引物，填補(bǔ)缺口，引物，填

56、補(bǔ)缺口，連接相鄰的連接相鄰的DNADNA片段片段1、雙鏈的解開(kāi)、雙鏈的解開(kāi)基本概念基本概念l DNADNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。復(fù)制原點(diǎn)。 oriori( (或或o o）、富含）、富含A A、T T的區(qū)段。的區(qū)段。l 從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子。復(fù)制子。l 復(fù)制時(shí)，解鏈酶等先將復(fù)制時(shí)，解鏈酶等先將DNADNA的一段雙鏈解開(kāi)，形成的一段雙鏈解開(kāi)，形成復(fù)制點(diǎn)，這個(gè)復(fù)制點(diǎn)的形狀象一個(gè)叉子，故稱為復(fù)制點(diǎn)，這個(gè)復(fù)制點(diǎn)的形狀象一個(gè)叉子，故稱為復(fù)復(fù)制叉。制叉。l 復(fù)制的起始復(fù)制的起始原核生物從一個(gè)固定的起始點(diǎn)

57、開(kāi)始，同時(shí)向兩個(gè)方原核生物從一個(gè)固定的起始點(diǎn)開(kāi)始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行的，向進(jìn)行的，稱為雙向復(fù)制稱為雙向復(fù)制 復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)原核生物DNA的雙向復(fù)制單起點(diǎn)、雙向等速單起點(diǎn)、雙向等速多起點(diǎn)、雙向等速多起點(diǎn)、雙向等速 DNADNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成：復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成： （一）預(yù)引發(fā)：（一）預(yù)引發(fā)：1 1解旋解鏈，形成復(fù)制叉：解旋解鏈，形成復(fù)制叉：l 由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNADNA的超螺旋及雙的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNADNA。單鏈。單鏈DNADNA結(jié)合蛋白（

58、結(jié)合蛋白（SSBSSB）結(jié)合在兩條單鏈）結(jié)合在兩條單鏈DNADNA上，形成復(fù)制叉。上，形成復(fù)制叉。2 2引發(fā)體組裝：引發(fā)體組裝：l 由蛋白因子（如由蛋白因子（如dnaBdnaB等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。 第一步：大約第一步：大約2020個(gè)個(gè)DnaADnaA蛋白在蛋白在ATPATP的作用下與的作用下與oriCoriC處的處的4 4個(gè)個(gè)9bp9bp保守序列相結(jié)合保守序列相結(jié)合第二步：在第二步：在HUHU蛋白和蛋白和ATPATP的共同作用下的共同作用下,DnaA,DnaA復(fù)制復(fù)制起始復(fù)合物使起始

59、復(fù)合物使3 3個(gè)個(gè)13bp13bp直接重復(fù)序列變性直接重復(fù)序列變性, ,形成開(kāi)鏈形成開(kāi)鏈第三步：第三步：DnaBDnaB解鏈酶六體分別與單鏈解鏈酶六體分別與單鏈DNADNA相結(jié)合相結(jié)合( (需需DnaCDnaC幫助幫助), ),進(jìn)一步解開(kāi)進(jìn)一步解開(kāi)DNADNA雙鏈雙鏈l DnaBDnaB蛋白活化引物合成酶，并在引物酶的催化蛋白活化引物合成酶，并在引物酶的催化下，以下，以DNADNA為模板，引發(fā)為模板，引發(fā)RNARNA引物的合成。合成引物的合成。合成一段短的一段短的RNARNA片段，從而獲得片段，從而獲得33端自由羥基（端自由羥基（3-3-OHOH）。引物長(zhǎng)度約為幾個(gè)至）。引物長(zhǎng)度約為幾個(gè)至10

60、10個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。為什么需要有為什么需要有RNARNA引物來(lái)引發(fā)引物來(lái)引發(fā)DNADNA復(fù)制呢復(fù)制呢? ?這可能盡量減少這可能盡量減少DNADNA復(fù)制起始處的突變有關(guān)。復(fù)制起始處的突變有關(guān)。DNADNA復(fù)制開(kāi)始處的幾個(gè)核苷酸最容易出現(xiàn)差錯(cuò)，復(fù)制開(kāi)始處的幾個(gè)核苷酸最容易出現(xiàn)差錯(cuò)，因此，用因此，用RNARNA引物即使出現(xiàn)差錯(cuò)最后也要被引物即使出現(xiàn)差錯(cuò)最后也要被DNADNA聚聚合酶合酶切除，提高了切除，提高了DNADNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。復(fù)制的準(zhǔn)確性。RNARNA引物引物形成后，由形成后，由DNADNA聚合酶聚合酶催化將第一個(gè)脫氧核苷酸催化將第一個(gè)脫氧核苷酸按堿基互補(bǔ)原則加在按堿基互補(bǔ)原則加在RNA