1、生物化學(xué)核酸概述和應(yīng)用核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。第一節(jié) 核酸是遺傳物質(zhì)的載體一、核酸的研究發(fā)現(xiàn)史1868年，F(xiàn). Miescher從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。1944年，Avery的轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)orand可分離1952年， Hexshey、Chase T2噬菌體（搗碎器實(shí)驗(yàn)）1953年，Watson、Crick DNA雙螺旋模型核酶（Ribozyme） 98核中（染色體中） 真核 線粒體（mDNA） 核外 葉綠體（ctDNA）DNA 擬核 原核 核外：質(zhì)粒（plas

2、mid） 病毒：DNA病毒二、核酸的種類和分布 核酸分為兩大類： 脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中 tRNA rRNA mRNA 其它 RNA病毒：SARS三、分子生物學(xué)的中心法則第二節(jié) 核酸的基本化學(xué)組成核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖元素組成： C H O N P 核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個(gè)核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層

3、析或電泳等方法分離鑒定。 組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為 -D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖。一、戊糖RiboseDeoxyribose二、堿基1. 嘌呤（Purine）123456978腺嘌呤AdenineA鳥嘌呤guanineG2. 嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶cytosineC胸腺嘧啶thymineT 核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。三、核苷（nucleoside）核苷 戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵12345(OH)12345(OH)假尿苷（）次黃苷（肌

4、苷）I黃嘌呤核苷 X二氫尿嘧啶核苷 D取代核苷的表示方式7-甲基鳥苷 m5G5OHAdenosine Guanosine Cytidine Uridine四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸HHHHHHHHH五、核苷酸衍生物1. 繼續(xù)磷酸化AMPADPATP2.環(huán)化磷酸化 cAMP cGMP3. 肌苷酸及鳥苷酸(強(qiáng)力味精)4. 輔酶 NAD、NADP、FMNIMP GMP六、多聚核苷酸（核酸）多聚核苷酸是通過一個(gè)核苷酸的C3-OH 與另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。55335-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3

5、-OH表示）多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，必須注明它的方向是53或是35。多聚核苷酸的表示方式DNA RNA5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGUT53OH U53OH OH OH OH OH 第三節(jié) DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)脫氧核糖核酸的排列順序可以用堿基排列順序表示連接鍵：3，5-磷酸二酯鍵磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架堿基形成側(cè)鏈多核苷酸鏈均有5-末端和3-末端 DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸

6、千變?nèi)f化的不同排列組合之中。 2. 基因與基因組基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。 蛋白質(zhì)（mRNA 蛋白質(zhì)）產(chǎn)物 tRNA RNA rRNA 調(diào)節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因無產(chǎn)物 作用未知結(jié)構(gòu)基因基因組（genome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和。包括：核基因組（擬核/核DNA）及核外（質(zhì)粒/質(zhì)體DNA） bp（堿基對(duì)） 103 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012人兩棲類魚類藻類酵母細(xì)菌E.Coli病毒質(zhì)粒各種細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大小3. 原核生物基因組特點(diǎn) 重復(fù)序列少，多位編碼

7、區(qū) 多為操縱子形式組織 有重疊基因存在 真核生物基因組特點(diǎn) 以染色體存在 重復(fù)序列多 基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project， HGP ）酵母基因組計(jì)劃 （YGP）大腸桿菌（）二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) DNA的雙螺旋模型1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA結(jié)晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測(cè)。在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。DNA雙螺旋模型要點(diǎn)B型結(jié)構(gòu) 兩條鏈反向平行，右手螺旋 堿基在內(nèi)（AT，GC）堿基平面垂直于螺旋軸 戊糖在外，雙

8、螺旋每轉(zhuǎn)一周 為10堿基對(duì)（bp）A型結(jié)構(gòu) 堿基平面傾斜20，螺旋變粗變短，螺距23nm。Z型結(jié)構(gòu) 左手螺旋，只有小溝2.0 nm小溝大溝雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)類型旋轉(zhuǎn)方向螺旋直徑（nm）螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基對(duì)數(shù)目堿基對(duì)間垂直距離（nm）堿基對(duì)與水平面傾角ADNABDNAZDNA右右左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.272007雙螺旋穩(wěn)定的力 氫鍵 堿基堆積力（疏水相互作用及范德華力） 離子鍵等 則DNA變性劑（熱、pH、脲/酰胺、有機(jī)溶劑）DNA的存在形式二、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋的進(jìn)一步扭曲構(gòu)成三級(jí)結(jié)構(gòu)，負(fù)超螺旋 原核 雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA

9、） 病毒 單鏈環(huán)狀DNA（scDNA） 單鏈線性DNA（ssDNA） 真核 雙鏈線性DNA（dsDNA）第四節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)堿基組成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋分子較小分類mRNA（hnRNA 核不均一RNA）tRNA rRNA （snRNA/asRNA）少數(shù)RNA病毒二、tRNA占RNA總量的15一種氨基酸對(duì)應(yīng)最少一種RNA分子量25000左右，大約由7090個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾成分。3-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)。tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)三、rRNA占RNA總量的80原核生

10、物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA 30s70s 50s16s5s 、23s 40s80s 50s 18s5s、5.8s、28s四、mRNA和hnRNA占細(xì)胞總RNA的35真核細(xì)胞mRNA的3-末端有一段長達(dá)200個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為 “尾結(jié)構(gòu)” ，5 -末端有一個(gè)甲基化的鳥苷酸，稱為” 帽結(jié)構(gòu)“ 。五、snRNA （small nucleic RNA 核小RNA） scRNA （small cytoplasmic RNA） asRNA （antisense RNA）第五節(jié) 核酸的性質(zhì)一、一般的理化性質(zhì) 兩性解離 / 一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），微 溶于水，不

11、溶于有機(jī)溶劑線性大分子（粘度高?？辜羟辛Σ睿┛捎秒娪净螂x子交換（色譜）進(jìn)行分離室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解加熱條件下，D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D2脫氧核糖酸二苯胺 藍(lán)紫色二、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)。以A260/A280進(jìn)行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光三、核酸的變性、復(fù)性與分子雜交1. 變性穩(wěn)定核酸雙螺旋次級(jí)鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變

12、。變性表征 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素 pH（或） 變性劑（脲、甲酰胺、甲醛） 低離子強(qiáng)度 加熱DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時(shí)的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。G和C的含量高，Tm值高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（2. 熱變性和Tm3. 核酸的復(fù)性變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時(shí)可復(fù)性，因此又稱為“退火”。 退火溫度Tm25復(fù)性影響因素 片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/ 溶液離子強(qiáng)度 4.分子雜交DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序