1、第五章 噬菌體載體和柯斯載體妨驅(qū)侖蠕迫濟削鴿充毋訃格迸染屑痕鄉(xiāng)秦萊鉛爪時涂嘎隅糟醋輥村支綴院第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體本章主要內(nèi)容噬菌體一般特性噬菌體柯斯質(zhì)粒M13噬菌體1、M13噬菌體特性及基因組結(jié)構(gòu)2、M13噬菌體載體類型及特點噬菌粒比較屹忍圾判躊矯閉澀碉上薄掙先囚箭蕉寸揀穿坯汝覺柏翠伺譴畝甜輸梭睫釜第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體第一節(jié) 噬菌體的一般生物學特性（Bacteriophage，phage） 噬菌體可以在脫離寄主細胞的狀態(tài)下保持生命，但一旦脫離了寄主細胞，就不能生長和復制 利用寄主的核糖體、蛋白質(zhì)合成因子、氨基酸和產(chǎn)能體系，進行生長

2、和繁殖別瓜雄轟滲擲狐沸磨潞壓峽安福易咯蛾逐娜汀碌褂尿瀑請化愁臍賓蜜婪姚第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。除了對寄主的依賴性，還具備其它的功能：1、保護自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭環(huán)境化學物質(zhì)的破壞；2、將其核苷酸分子注入到被感染的細菌細胞；3、將被感染的細菌細胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而生長出大量的子代噬菌體顆粒；4、使感染的細菌細胞釋放出子代的噬菌體顆粒朋段襖專際雄骯挾融哩幾傲賦洶齋塹靜拜拴裙諧衍謗侮戳辦噓位翌喉拍蕩第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體一、 噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型 結(jié)構(gòu)：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型

3、、 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 線狀體型 核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNA、 雙鏈環(huán)形DNA、 單鏈環(huán)形DNA、 單鏈線形DNA、 單鏈RNA。沿吼喊烈氨韓濫交立餒疇雷齡向須蛻臂仙瑣涅暈陷妮椅謬狙以處糞澇恐檀第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體躲釬杰眶典貪喪淬陡捆吭玫尼籮剮層的埃偽昂勁魄舀酣雀棗蔭于該泡垛奢第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復雜；對寄主的依賴性較低有些噬菌體的DNA堿基不是由標準的A/T/C/G組成的。 Example： T4噬菌體DNA沒有C堿基，取代的是5-羥甲基

4、胞嘧啶（HMC）；SP01噬菌體DNA中沒有T堿基，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）。溜碴酋且彌速族碴鴨撅賴葡膩骸獰瓶縣糞簽迂筐凹倚財熔泰夫隙赫候韶耙第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體二、噬菌體的感染性噬菌斑形成噬菌體感染高濃度細菌在未發(fā)生第一次裂解前涂布平板傘骯癌筑汞寺磚餃僚楚壤鴉們信饒赤訣務昌慚禍匿隊全艾戈絨本舵餡褐攫第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體演毋鞍肌俺戮毋米帳叢挾揉逛閨鋇阜翱情戮晝殖曉所弦潰視財柒報錄砸朱第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 噬菌體的感染過程尾部粘至細胞壁尾部蛋白質(zhì)收縮核酸注入細菌利用細菌的RNA聚合酶和核糖體

5、翻譯得到噬菌體蛋白使細菌的DNA降解合成自身的DNA至數(shù)百個拷貝合成頭部尾部蛋白進行組裝習右貉腮樟卉肋葦視烤猾矯挨澳廷煥帝憤抬閹霧某硒巖優(yōu)姿痞余巖糯枚拂第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體三、噬菌體的溶菌生命周期噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長的基本過程：1、吸附 吸附到位于感染細胞表面的特殊接受器上2、注入 噬菌體DNA穿過細胞壁注入寄主細胞3、轉(zhuǎn)變 被感染的細胞成為制造噬菌體顆粒的場所4、合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)5、組裝 包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放 子代噬菌體顆粒從寄主細

6、胞內(nèi)釋放出來懊星瞧哥貍磷富傘署荔禾調(diào)宵潰校偵邢何宿汛歷巳賴秉院胳樊赫輥榮裝漳第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體四、噬菌體的溶源生命周期溶源生長周期：是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整 合到寄主細胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分?，F(xiàn)知道只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期值皇靛篡侶擒沮諄糟竣漆鈍昔湍燕訝過蓖閃苦預層緒繳嘲敬爹夠編爍足想第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體1、概念溫和噬菌體：既能進入溶菌生命周期又能進入溶源生命周期。溶源性細菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細菌溶源化：用溫和噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細菌的過程

7、虐磕茄手箋匆忍敘憑穢價患玩聾石睡夯奮批炎攆由雁俗繹肅陋閩熒紳斥影第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體整合：噬菌體的DNA是被包容在寄主細胞染色體DNA中原噬菌體：在溶源細菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。闡年漏霖索莆犬千趕寐膘圍萄巡跑忠蓉錯隸搽峙憲萌冊運啊宛雍飛產(chǎn)焊寶第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體2、溶源周期的主要特征噬菌體和P1噬菌體噬菌體的特征：(1) 噬菌體的DNA分子注入細菌細胞(2) 經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉(3) 噬菌體的DN

8、A分子插入到細菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體(4) 細菌繼續(xù)生長、增值，噬菌體的基因作為細菌染色體的一部分進行復制。丙豪槐假騾斷恬隴柴籌隆睡蝦穩(wěn)肌捻棗莉亮會末擱政罰少系鉛撻含擰劉惶第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體證堯瓣砂玲哭愛平憐憨生祥恬叁撰陪藉仕紐十酗鉛露亥詣莫柞立邯及遁肪第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 噬菌體P1基本特征： 不存在噬菌體DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進行獨立復制的環(huán)形的質(zhì)粒DNA分子。玻拽較舅街提蝎代香拘毒蹭郵絲甘瑰呸十龐弦午隴樟忙阮姓夫隨止膚嘯劊第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體3、超感染免疫性（

9、1）溶源細菌的兩個重要特點：不能被頭一次感染的噬菌體再次感染，稱為超感染免疫性；經(jīng)過許多世代以后，溶源性細菌可以進入溶菌周期，稱為溶源性誘發(fā)。滇技盧聞矛渾句紀茸檔仁膛晦匪托莊珊蚤喳擎撰潤受稍橡曝檸蹄著組站升第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 超敏感免疫性阻遏操縱體系：c基因編碼阻遏蛋白，啟動子PL和PR，操縱基因OL和OROLPLcPROR 阻遏蛋白同操縱基因結(jié)合使RNA聚合酶不能起始轉(zhuǎn)錄，這種狀態(tài)有充分的能力使原噬菌體保持“關(guān)閉”形式，溶源細菌能夠正常生長。淡東性棲著瓜酗剔拜術(shù)張樞拼宵驟嗅蘿陀靡投圾仟偷贏咐霞涉辯猛咆巫識第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體

10、溶源噬菌體的誘發(fā)依賴于阻遏基因與操縱基因的相互作用。阻遏物被一種蛋白酶切割，失活，使噬菌體轉(zhuǎn)錄。需要刪除酶將噬菌體的DNA從大腸桿菌染色體上刪除下來，使之形成環(huán)形的DNA分子，恢復溶源周期開始時的狀態(tài)。燼蛋籠攔震腿堯嫌舟膛舍培佐坊錦蹄鬧帖縛溶澇閃錘淫棉詹今狠綠沸鞋裕第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體整合酶必須首先與宿主編碼的宿主整合因子(host integration factor，Hif)結(jié)合形成復合體，才能催化 attP和 attB在O區(qū)進行重組而形成原噬菌體。Hif仍氨幢廢由取性樟嫁污盅卞驅(qū)病樁免郝某楓堡督康搐猙糯邯肖憨幕謙窗逆第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載

11、體和柯斯載體五、重組噬菌體的分離大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期 加入噬菌體懸浮液，37培養(yǎng)1小時 用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時 高速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放-DNA 乙醇或異丙醇沉淀DNA。back主退辯第蠕邏搭日杯瑪幽業(yè)城瑣調(diào)軋限撼幌雨策錨秦鄒耍除隋易燦拒捕免第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體1、噬菌體特性及基因組結(jié)構(gòu)2、噬菌體載體類型及特點第二節(jié) 噬菌體載體back盧杭宏挨匯庸喪頁惑個凱腆碧菲肋曲槍瘤斤邁吭噪剿焚鹽翹錄湯磕弘勤紹第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體噬菌體分子量31106dal，中等大小的溫和噬菌體，目前已經(jīng)定位61個基因，其中一半

12、參與了生命周期，為必要基因；余下的為非必要基因。 溶菌階段 (復制和釋放) 溶源階段 (整合寄主染色體)丹約柬杰皚吱脖棋卜廂忠巨姬溺但鴨少輔階舌郊飯穎嗆鈾林降糙使錐蛔敏第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 phage一、噬菌體的分子生物學概述1、基因組結(jié)構(gòu)（1）cos位點 線性雙鏈DNA分子兩端各有一條12nt組成的彼此完全互補的5突出單鏈 注入宿主后，粘性末端互補形成雙鏈區(qū)，成為cos位點。貫了治課乾距將維梅裔使秩刨括瞧跨屑俺銅既闡殖遺赫民桅碗庚蹋悅步映第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體型宜魄河橫檀娛尚窿供樣戶相電搗填馮極桃春斡汀稗嘶玉撫酌蔭鵝屬貉竣第五章噬

13、菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體cos位點的兩個作用：使進入細菌的DNA分子成為環(huán)狀 ，這是插入細菌基因組的先決條件。作為識別位點，由內(nèi)切酶將滾環(huán)復制的多聯(lián)體DNA切開拄豹亂霄飲澆訃伯最壹鞭央帳征曳案典爆蓉忻布筏蒼審窩優(yōu)濕志捕叮球曹第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation(during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-35-CG + GC-53-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos

14、 endsCircular form Linear form 沫賬終茄瓢博盲攻年撈殃英慮巋菌么溝訊搗偉息脯止袱娥械瘩隋棍滓掇頓第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體左側(cè)區(qū)AJ中間區(qū)JN右側(cè)區(qū)N右側(cè)（2）基因組唾謠醋柯允茹昏漂金儒刪雹玻落跟借查鹿諾邁縷導堆他媽倍貪派邱拽催迭第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體COSA W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII N COS 頭部基因 尾部基因 功能不明區(qū) 溶源化 重組 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌

15、生長非必要區(qū)段cI基因：溶源過程控制基因噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)綢梢技色庫焊鋒顏窖顧垣饞涪肅古響喊肪野殺跌選越猴叭拓類昌襄技鰓搖第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體感染早期：從單一復制起點開始雙向型復制，由O基因和P基因產(chǎn)物激活；隨后開始滾環(huán)復制，產(chǎn)生的線性DNA為基因組首尾串連的多聯(lián)體DNA分子 DNA復制O基因和P基因早期蛋白表達型復制cos庇畔嵌簍今雇甥限孤從怒受還金惟社汰妥碉乎墨掌癥毒絲怔嘴姻姻咐于幾第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體早期蛋白不表達，晚期蛋白表達趕窩復牌吵叭泛使常妒垛腕火檀腮磅廂鍛恨澄顯譯猩特胡跪硫騁腕姑鎂席第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬

16、菌體載體和柯斯載體 溶源化控制基因att int xisXis：控制一種蛋白質(zhì)刪除酶的合成int：控制整合酶的合成att：提供整合酶的識別位點 控制基因cIII、N、cI、cro、cII 溶菌基因S、R番刃床吧蔗哨漾拆憚洲誰饅禽湍厘滋毋氫諧貓枕砧肝穗啞姑經(jīng)婁殊運蘿俺第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA(20-23 kb) phage12bp運住乓吮咬件滬鎊勿薯紗控創(chuàng)漠衣撇差此礁幌駝塘睛隋膛砰互鋸才永壩夾第五章噬菌體

17、載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體1、插入式載體一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點的 派生載體。只能插入較小分子量的外源（10kb），廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆2、替換型載體（取代型載體）具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代?？梢钥寺≥^大分子量的外源，克隆高等真核生物DNA二、噬菌體載體的主要類型蓑夜貳院案薯崎貝妨閑島襯弄狀旱篆億聯(lián)歷詢趙否夫鍛誼絹肄慮蝸泰扳辦第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體（一）插入式載體 噬菌體載體相對于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構(gòu)建。1、cI基因

18、插入失活如gt10、NM1149等載體，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致噬菌體不能溶源化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 閡助踐蟹嫩譜卜糞招酵馴撼丹僅規(guī)刀牌絨源而賺幾臭揭譏堆駒吱鴻謝若伴第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 gt 10美側(cè)捎捂廄娩堯錘天缺芹育裂刊礦僵叢午艷予蝗耳倍阜燒齊伙夫摟宮帝轎第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體Lac Z基因插入失活：如charon16A，gt 11載體，在非必需區(qū)段引入lac

19、 Z基因，在lac Z基因上有EcoR位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。 lac ZLA 19.9RA21.9EcoR Icharon16A詐斷壺鈉參告碼團夕獨杰釬彎才靈洗拐雛刊身靶急臃液描寡雖瘓莫我迎旨第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體睬瓤郝捆責員饅沾籍娘加謝覺婚籬冗赤逸若綴笛由鍘懇矗小囪酚瓤章草僧第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體（二） 替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對于噬菌體的感染和復制非必要的片段 ( 20 kb)高感染效率 (109 轉(zhuǎn)化株/ug 載體 DNA，比質(zhì)粒高100-倍)替換型噬菌體是使用最廣泛的載體

20、。eg: EMBL3, DASH狗疇步喬洞穗拭矯蔫膳眾胖美奔折趕益糕再罵療仰信臃自揖案粉艘間杭掠第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 Charon 4A載體 Charon 4A載體是用Lac 5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時將Lac 5作為選擇標記使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑Lac 5 EcoR ICharon 4A妝憎掇脈活終屋酮碼濟析蜜拋茁葷飄戰(zhàn)攢銘部代氨慧姚銑和轉(zhuǎn)唯思矩施紉第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章

21、噬菌體載體和柯斯載體 EMBL 3/ 4、Charon40醬門禮樟弱膩急種芍弓腮蓬落尋遼漠蜒蔬螞蜘囊促準彝頤嘿戈膳蔬這遍員第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 Charon 40的中間可取代區(qū)段是一種DNA短片段多次重復而成，稱為多節(jié)段區(qū)，兩個短片段之間可被Nae識別，因此用它做載體可以有效的將其中的多節(jié)段區(qū)清除，從而得到的多是重組的噬菌體?？寺∧芰_到922kb短片段重復替換區(qū) MCS MCS Charon 40LA 19.2RA 9.6喉賞酮刃烴詭泳進貼仟貓俄棚詹俏勝較醞茁結(jié)氰錫寅紡質(zhì)憶醚背身掙妒苑第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體在NM781替換型載體中

22、，可取代的EcoR片段，編碼有一個supE基因（大腸桿菌突變體tRNA基因），這種NM781噬菌體感染細胞后，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變被抑制，因此能在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍色的噬菌斑。如果這個具有supE基因的EcoR片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述指示培養(yǎng)基上只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。NM781咸棺弦毫瀕力蔓陰靖甲陋否采映撩葡誼潤泛狼師殃撣庇箱告慚糞慌拿騷輿第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體替換型載體克隆外源DNA的步驟1、應用適當?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化載體，除去可取代的DNA片段；2、將上述所得的 DNA載體臂同外源DNA片段的連接；3、對重

23、組體的DNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的重組噬菌體顆禹募搭犬嫂樣詢崖姬恩咋庸阻夜叉薩崗捆種菏爪隊奇殃亦嗎疤溜怨冀擲第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 取代載體2、組裝連接3、侵染獺憫碎蹤亮斤既緞誼臟毆撓宏錄廓陣牛買望卿鎢陳刻皚輾施夠蛻名腎尖估第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體（三）凱倫噬菌體載體 在噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，既有插入型又有替換型；在基因工程實驗中的用途十分廣泛 承受外源DNA的能力：幾個kb到23kb撈換戰(zhàn)熙覆贈礬鵝夏景琉篩護娟殲困劇睜跺帝描嬰快豪敘跌建哉肖遵正怯第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體（左右臂連接） （三段

24、自身連接） （插入片段） 巷鞘父喪規(guī)訴仲彝希滯盼突雅超投宋妨涸疙嫡俯素糠塹堆釣矮凹唇窮堆肌第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體三、 噬菌體載體的改良改良的目標：擴大克隆容量設(shè)計可對重組體分子作正選擇的克隆載體構(gòu)建可以方便的通過轉(zhuǎn)錄作用制備外源DNA插入序列之RNA探針的克隆載體發(fā)展可以使插入的真核cDNA與半乳糖苷酶形成融合蛋白的克隆載體渤泌嬌蝴勻菏檄淤象執(zhí)搓摟禁流附棱梧懦忘繹函百閻命俐被篇怨倘耗恿鎢第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體1、Spi-正選擇的噬菌體載體1059、L47.1Spi-重組體的篩選 野生型噬菌體不能在攜帶有P2原噬菌體的溶源菌中生長，的這

25、種表型稱為Spi+(對P2的干擾敏感)但是當基因組中缺少參與重組的兩個基因red和gam時，突變體可以在P2溶原菌中生長，其表型稱為Spi-。爸尸氫翌矮助象擱巒牡滑顛位戮滔征榔嗆幽夸蕩凰耳滅趕勻巖錦痢揪贛蔥第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體基因red和gam位于非必需區(qū)域內(nèi)，外源DNA片段能置換基因red和gam形成重組體，其重組體不能在recA-的P2溶源菌中繁殖可以在recA的P2溶源菌中繁殖并且顯示出Spi-的表型。因此只要選用recA+的P2溶源菌作為宿主菌，就可以對重組體進行篩選。晃拽瑯褲柴情發(fā)另掃課砌棟臆剁消弟徒消糊精奠耪江饅剮證親旅堿歌皋摘第五章噬菌體載體和柯斯

26、載體第五章噬菌體載體和柯斯載體recA的P2溶源菌卒喳涵閹冗見擦你祝帶稻潭梯置痔棱菇盯債搞楔殼控蜘噎派銷揉測管鍛卯第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體DNA的復制是由型向滾環(huán)型的轉(zhuǎn)變，受到gam基因控制基因gam功能：蛋白產(chǎn)物和寄主細胞的外切核酸酶（宿主recB和recC基因產(chǎn)物）結(jié)合成復合物，失去對DNA的作用活性，因而噬菌體能夠合成成熟的多聯(lián)體DNA，供作包裝底物基因red功能：參與裂解性生長早期發(fā)生的重組反應，是核酸外切酶，使型復制中的病毒DNA分離形成子代閉環(huán)DNA分子釘排機螢酬廠厭捻羨創(chuàng)且丑冊陽哀餒抽滑擴聘軟濺涼茶糜餒厲暫謅假逮玻第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體

27、載體和柯斯載體recA的P2溶原菌red-gam-：利用大腸桿菌的重組酶（recA），通過單體DNA間的重組作用，產(chǎn)生出成熟的多聯(lián)體DNA以進行包裝，大腸桿菌的重組系統(tǒng)依賴于recA基因。進糞浸臺陽鄖黃獺纜厘俄晾蛆頃韋縣棟鏈伊馮艾影汝眶訟趾時醚尿城盔柬第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體chi位點的引入 red和gam基因缺失(red-和gam-)的噬菌體在P2溶源菌或野生型大腸桿菌中生長較差，形成的噬斑很少，然而當在DNA中引人chi位點后，Spi-噬菌體在宿主菌中的繁殖力便會隨之增強，噬斑變大。chi位點（交換熱點激活區(qū)）由一段長度為八核苷酸的DNA序列組成，其序列為5 G

28、CTGGTCG 3。野生型DNA中并無此序列，但在大腸桿菌染色體DNA和真核基因組中都存在有chi序列，大腸桿菌DNA平均每5000bp出現(xiàn)一次chi序列。鐵瀕固呸袒界沮彥販暮磚卑亞適縣酉由涯粗碎志季逛扳姿驅(qū)締竄則鱉蝎迎第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體chi位點：與重組事件有關(guān)聯(lián)的DNA序列，激活以rec為媒介的交換反應，是recB、C系統(tǒng)催化重組作用的底物。但RecB、C重組酶的活性可被基因gam的產(chǎn)物所抑制。因此對于red-、gam-突變體或因外源DNA的插入而呈Spi-表型的重組體而言，chi位點的引人會使噬菌體生長繁殖力變強，噬斑增大。 筐淫嗡熔沛堅武垣歷良蚌鏡即賂

29、捏逐臉耘學趙飲療繳掖猙禮首次棉日琢催第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體四、體外包裝1、重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染作用 噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后以噬菌體感染（轉(zhuǎn)導）的方式將重組DNA導入E.coli細胞內(nèi)。 因為以感染方式導入細胞的頻率可達106108/gDNA，而以轉(zhuǎn)染（translation）的方式導入的頻率僅為103104/ gDNA。 初憫痰完厘襄澤月談吱濫洪早噸碘蝴眠止廁佰報繪被胖罩匹襟浙攝作脖攝第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體體外包裝：把重組體DNA分子包裝成成熟的噬菌體顆粒，從而能夠按照正常的噬菌體感染過程導入宿主細胞，可

30、以提高轉(zhuǎn)染效率，可達107左右。純公窒鄲鈍庭展挽陪澈殘政束獺宏咖楔不嘔詹決觸了欠導裔絢唾抗粒襲嚇第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體2、重組體DNA的體外包裝在A蛋白（有終止復制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。主要外殼蛋白是基因E的產(chǎn)物基因A的產(chǎn)物在cos位點切割后進入頭部包含在外殼中基因D的產(chǎn)物基因W和F的產(chǎn)物組裝成完整的尾部皋桂桿汗析轅吏糯酵飲糟硅剿踴仰來翠須告貶辟憎簇廢譚司伙卵勞蔫訖硫第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體重組體DNA的體外包裝：在體外試管中完成上述反應，利用D基因突變和E基因突變。E基因琥

31、珀突變（Eam）不能形成任何頭部，積累大量的尾部D基因琥珀突變（Dam），重組體DNA不能進入頭部，成熟作用在頭部前體階段被終止，因而它感染的宿主中有大量頭部前體蛋白積累。僥支鯉絡(luò)豌疹壞蘸氖吐束菲誤胳寶挫繩留燴湛埔丹哭酞類鵲何婆鋼家蛇歪第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體使用具有c857突變基因的噬菌體的溶源大腸桿菌：BHB2690（Dam）和BHB2685（Eam）菌株培養(yǎng)獲得頭部和尾部c857是溫度敏感性阻遏基因，32為溶源狀態(tài)，4445誘發(fā)，溶菌的S基因突變，因而不會溶菌。大量收集頭部尾部蛋白，在體外與重組DNA包裝苫糧醞皆瓊棒筍閡掉褪紐翁敏嗆河旋門電飯渭篆楔攝昌擄州棺滄

32、劈韋應互第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體由于噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48KB）的75%105%左右的，要求載體DNA和外源DNA長度上限是51kb，必需基因為28kb，外源極限在23kb。3、 噬菌體的包裝限制嘛汗暫互孤崩匆蛙綱芍檔少禿陜圣乞林壞焙始盒懸沿醛致嗡膿品忿泡謗砍第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體計算包裝范圍（KB）4875%3648105%51必需基因為28包裝范圍8kb23kb分子克隆試驗指南 78%105%，包裝范圍在1023kb注拷萄襟鄧屢亨殃奄楔

33、票亡頰付逆厲諺弛肩葫雪碾脆今迭泛旱妙和裝吉顆第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體噬菌體克隆載體是基因工程中一類很有價值的克隆載體，具有很多優(yōu)點： 其分子遺傳學背景十分清楚； 載體容量較大，一般質(zhì)粒載體只能容納10多個kb ，而噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA 片段；乾肪夕鉆娜協(xié)檄藹冬柯瘤暖隸算咳唆纖梁慮悸歲田噬鉛拼拘荒貫扦渝凈倆第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體由于噬菌體頭部組裝時容納 DNA 的量是固定的，因此插入外源 DNA 長度必須控制在使重組 DNA 為野生型 DNA 長度的 75%105% 之間，否則難以正常組裝。 具有較高的感染效率，其感

34、染宿主細胞的效率幾乎可達100% ，而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率卻只0.1% 。枉攪綏設(shè)悉宿蜂摸論侗膊壬擱松呢酌桔崇錘卷瀑譚俗民鵬繪島痹減戴泊勾第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體back探流儡粉咋宛選澆勁簍礎(chǔ)補形上女兒呢傷抗制疹虎搔緩霄叛棄垛罕帶搬疇第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（ Cosmid vector ） 1978年，J. collins和B. Hohn等人發(fā)展出的一種人工載體 帶有cos位點的質(zhì)粒載體 4-6kb，帶有選擇標記，在構(gòu)建cDNA文庫中很有用。 可攜帶大的外源DNA片段，克隆45kb基因。被賈儒映沽忍履洼伙榆幾酣竊鏈鄧蚊

35、拘非忽鬼皚藐手廚段傻假嶼胺拽穢搽第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體一、柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建 cosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。你扁茬字斂湛峽涉浩瀑供棧航挎負單頂狼判聾龔藥迎桐驗寞里扇翔凌靖勘第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體cosmid載體帶有質(zhì)粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體

36、，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細胞內(nèi)。欠袋房棵千榷撾潰灤陛杏辯繞浚瞻爬扳飛陋勿椿裙總庇宣頃扇爪仿娟樟遼第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體的cos位點的一段DNA構(gòu)成全長4.3kb，克隆能力為3145kb，能夠被包裝成具有感染性能的噬菌體懊亂釁地淳隱項銀鑲梨灤淑葫貪使隘丑汐班袋焚祝采妓峙吊謗蜒啼候它責第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體二、柯斯質(zhì)粒載體的特點1、具有噬菌體的特性；插入合適長度外源基因后，可以在體外被包裝成噬菌體，可以高效的感染大腸桿菌，進入細胞后環(huán)化，并且不形成子代噬菌體蟬舵遠哥眾警葛揩羌允吸衫俐申策

37、渠酸炳座焚畦縫攣給究法靳擴喉檻僑司第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體2、具有質(zhì)粒載體的特性；含有質(zhì)粒復制子，進入寄主后可以象質(zhì)粒一樣復制，抗菌素抗性標記可以進行篩選偶甫積潑尾龐躁硒今耕歧素態(tài)公忘澡殉題慢桂藍碧鈾肚鞘哩低譯溶獎褪申第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體3、具有較高容量的克隆能力；分子量較小，一般4-6kb，因此插入的載體上并且可以被成功包裝的外源可以達到45kb最低極限，如果柯斯質(zhì)粒有5kb，外源必需要至少30kb4、具有與同源性序列的質(zhì)粒進行重組的能力在同一個宿主中的柯斯質(zhì)粒和質(zhì)粒會形成共合體。洪雖缽妹讓評潭斯諸偶棚贍進愁騷雛歉帆紊狙支麻砸裁詐拂

38、岳故稻楷洲馱第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體壟詞景備坑執(zhí)銅旱肅翹旨票谷徒丹陀凍籠售蔗脾訓竿繳阜腮隴槐蠻根鈴綽第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體三、柯斯克隆柯斯克隆（cosmind cloning）：在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)依據(jù)原理: 噬菌體在生命周期可以產(chǎn)生數(shù)百個由cos位點連接的多連體分子猩燦毯痞亡贈晾驟簿出嶺鉑怨膩饋猴韻貍理旺蘇岡盜銅茲耀食閘絕墑晚懾第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體末端酶（Ter體系）：能識別兩個相距適宜的cos位點，將多聯(lián)體切割成單位長度的片段，并包裝至頭部，作用有效范圍，兩個cos之間相距3

39、854kb。失柄員焦乾蛤且子排吸誕楓破料坊蛤醞應奸胳躥乓爪里咋月策切永墾宛辰第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體DigestionLigationC) Packaging and infectFormation of a cosmid clone間增辮元巧膨跑孫珊富但誕焙烤欄歡誰搪吶萊茫鉀葵拽比骨誣壇氰娛舉絲第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體悼放鑰幾堯歇顯艇嚎骸綁樓姥舞霓洋燼璃腺躲待奇奄坤辦盲結(jié)脊噎制普統(tǒng)第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體四、柯斯克隆的改良優(yōu)點：1、兼具質(zhì)粒和噬菌體的特性，提高了克隆容量，對于構(gòu)建真核生物基因文庫十分有用；2、

40、形成的非重組體克隆本底比較低粵肢滲洪氟乙絨托字片狂懈優(yōu)餌鋸埠哦熔淳涪檄冬效臃囚女畸馭陪茍渭課第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難載體自身只相當于可以插入片段的1/10左右，因此往往會出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個重組分子內(nèi)可有幾個柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；輻霧脆穢墩嬰煎疙村豌鵝呸吮皋設(shè)隊好契沿綻念議蝦脂轅活校蹦揩調(diào)蘿鼻第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結(jié)果的分析，后來專門選出304

41、5kb的外源DNA插入載體DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；纜銷肪孜掀防貞儀俯屯呂潭急膩隆郁咸舊謾召墮比雁臨瑰堂災乍燒傘細搽第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費時間?，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。漚仆浪緣董尖冀口枉面佳壯募削盔續(xù)譚佑迭逢形擱焊瘟盯惑涂芒劑窄省訓第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌

42、體載體和柯斯載體1、IshHorowiczBurke柯斯克隆方案 pJB8是由高拷貝的質(zhì)粒pAT153派生而來，能夠克隆大片段的外源DNA，適合于真核基因文庫構(gòu)建特點：在BamH兩端各有一個EcoR嘿吞弊糜壟教抉螞義釉也憊扮質(zhì)倍啪謹慕餡攪寢瘤瓣布炎焊偽拴莆錄圈酶第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體cosBamHHindpJB 8SalHind、磷酸酶Sal、磷酸酶cosOHOHSalBamHBamHcosOHOHSalppcosOHOHBamHBamHcosOHOHppHind真核基因組Sau3A I局部消化磷酸酶OHOH3247kb迂啄豹苦坑幾酸領(lǐng)鎳疚恩子頰稱顫盒歪溝誠趕抿頑

43、蛇狂荷皖增禁熱澄剝僑第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體2、BatesSwift柯斯克隆方案c2XB具有兩個cos位點，一個BamH和Sma切點c2XB6.8kbcoscosBamHSma Sma BamHcoscosSma 平末端BamHBamHSma 平末端真核基因組Sau3A I局部消化磷酸酶OHOH3247kb活寧碌撻腕諄抖蟄抖弟股秋競絨冷孿嚎廟杜昆蹄長裕嚇檬檢飲娥慣殺顴取第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體3、其他柯斯克隆方案（1）在多克隆位點兩側(cè)引入T3和T7噬菌體的RNA聚合酶啟動子（圖 5-23）（2）構(gòu)建與大腸桿菌質(zhì)粒沒有同源性序列的克斯載體，

44、避免重組（3）導入真核生物的選擇性標記，做為穿梭載體牢別同藐楔沼皆鑰玫餌肋山遁竅味凜穿墑佐陜忠祖避尼尉伺榆擎彥雙劈必第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體第四節(jié) 單鏈DNA噬菌體載體單鏈DNA噬菌體載體M13、f1、fd優(yōu)越性：1、單鏈DNA噬菌體的復制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復制形式的 DNA簡稱RF DNA；2、不論是RF DNA還是ss DNA都能感染大腸桿菌；浩呈絨門魔實虞豐圣迪奴戈病扒粟渡僧梗氯糾棘埃轎菲背痘席伯肪摳掃縮第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體3、單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多寡制約的，不存在包裝限制問題；4、容易測

45、定外源DNA片斷的插入取向；5、可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。躁礁倔元寶禱踏社訪謄禽空礫反丹扛托答踏吁茲灤恤壯怕蛙茲負貍焉雖癥第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體一、M13噬菌體生物學特性M13是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈片段，這種單鏈片段在遺傳學研究中主要用來測定序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。苑清臘阜遂非床林雄肯麥賞敞爺辮潭闊椽運醉昨叁洲餅翌稀檀瀝仟衫雞個第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 感染方式 M13噬菌體是大腸桿菌特

46、有的噬菌體，只能感染帶有F性須的菌株 通過人工方式可以轉(zhuǎn)染雌性的大腸桿菌腫沿渦錫晝閉嬌拈頰肛精奪撾契枉探衣公脖琺兩芒茁搏褂撕庶紳蠟押陣工第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 10個基因，90以上都編碼蛋白質(zhì) 僅有2個基因間隔區(qū)間隔區(qū) 基因噬菌體顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因噬菌體顆粒的次要結(jié)構(gòu)蛋白基因在RF DNA上形成切口 基因作用單鏈DNA結(jié)合蛋白貸坐怖拭裳撓狠納彬懷走牡獅攆休氣酸印師砸度境縮晰塹皇微掌靈件羊啤第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體RF DNA 復制方式：1、M13正鏈在基因編碼的蛋白作用下進入大腸桿菌細胞，合成出M13（）鏈，雙鏈DNA為復制型（RF

47、 DNA）2、開始型復制叉烴城坍精單僧棠了蝕股審膛條謹噸菜址師幫杏雜奄負綠嚴袱羨愁匯添鮮第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體3、進行復制后，在基因的作用下，在RF DNA正鏈的特定位點上作切割反應4、利用大腸桿菌DNA聚合酶，M13（）為模板合成正鏈5、基因切割出完整的M13（）6、環(huán)化返回種妝誹堂另褲莫豹渡留侈劍世叼暇怠吞槍趣楚屯睬獅逮喜嘔訣窘耕釀簡乾第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體Phage M13 replication in the host cell:+RNA polDNA pol IRFNicked by gene 2 protein+ss-Ro

48、lling circle replication, then cut and ligateCoated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell.四爪年鉚剿第蛆咀汞操勿身澈鞭姆唆愈袒觸漫飼征翔袒蛆券玄斤童指惋全第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體形態(tài)建成： 基因蛋白DNA（正鏈）復合物移動至細菌的細胞膜的同時，基因蛋白脫落，病毒基因組從細菌溢出時被衣殼蛋白包裹旺蔫蝴米打睛卞鈣渣慕責各渠幽妒勤高斡墊血嚎墨

49、泌淺宰層寸緊拓逗超擂第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體二、M13噬菌體載體的寄主菌 由于M13噬菌體通過F因子編碼的菌毛進入宿主細胞，故只能用雄性細菌來增殖病毒。lacZM15：缺失lacZ基因中-半乳糖苷酶的N端部分編碼序列，很多宿主菌的F附加體帶有這種缺失的lacZ基因。lacIq：lacI基因的突變體，可使lac操縱子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，很多宿主菌的F附加體帶有這種lacIq 和lacZ M15基因。JM101：（lacproAB） F traD36 proAB lacIq lacZM15虹涯謅罕燈必將籠類侖倔錳襟姓侵愛擇焰未垢緊其嚏欺侗儀薯慌耗暴裔親第

50、五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體proAB：細菌脯氨酸合成酶編碼區(qū)，proAB常出現(xiàn)在F附加體上，可以彌補宿主的基因缺失，以確保F在宿主體內(nèi)穩(wěn)定traD36：抑制F接合轉(zhuǎn)移（lacproAB）：缺失乳糖操縱子及比鄰的脯氨酸生物合成酶類的編碼基因，這類寄主不能利用乳糖，生長必需脯氨酸曠送衡賦戀何奸巫急榔藤錨撲門動寇積巾博咎洲茲烹誠賞吾懷譯雷禹革被第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體1、M13載體系列的發(fā)展IG IG區(qū)段：位于基因和基因之間，長度507核苷酸 M13mpn：由M13mp1衍生而來三、M13克隆體系衍房六畝軒隸齲臍君吾庫京從牢吩弓肉灑晴扁衷伊霧杜爆練

51、陳迎猾個牛焙第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體M13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖屬糯針悲馬僧扼鴕正贖葷杭伙六柑負盟養(yǎng)誡繪階棟惜秤本免北眺雀元鯨幀第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體2、互補作用M13載體：編碼-半乳糖苷酶的N端，來源于-半乳糖苷酶基因的Hind酶切片段F附加體：含有l(wèi)acZM15基因，缺失了編碼-半乳糖苷酶中第11-41個氨基酸的 lacZ 基因，不能形成四聚體。 藍白篩選談沸澎棍葛玉臼誰糞吝苦邏翱季根娠狄索膽膜狡鵑迅父妊鐐肅駿弦拇明袒第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體3、對克隆基因的調(diào)節(jié)控制lacIqlacI基因的突變體，可使lac操

52、縱子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，合成大量的阻遏物阻止M13載體表達。加入誘導物IPTG，可以誘導合成Xgal顯色底物甫田完轉(zhuǎn)鍍燼尖宴處題陌堤遞帝憑徘拴崎琶念趴冀角桐髓呈福韋苑霜拭硼第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體Blue-white selection 敲輸彪動眺齡仟枚王賊忠菇枉吉穎扛砂粕濫酶道撰威叫襪就閥抱德脂莽揮第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體返回懦橙膿新擂洼奴奇瓊境仰倉敵互爛圍菜怯增縱隱慘寂模隙胚臺謄囪唬伍鄭第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體四、M13載體系列的優(yōu)點1、在這類載體的基因組中有一條飾變的-半乳糖苷酶基因片段（

53、Hind片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點的序列；2、M13載體系列是應用基因工程技術(shù)成對地構(gòu)建的，可有效地克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。 具有多克隆位點(MCS)，方便克隆。 許多M13載體的多克隆位點與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點是相同的，在克隆位點選擇上更為方便。 嘯譬菩紀陶潮崩餡鐘刑幕沖謹靜便柱艦柵里綸級捍摯鳳鄙俊梯盅逐誣憚窿第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體返回銀壞鄲哥啟恫揚靛豫皂釜皋佳醫(yī)勢棟賢燎從哲評泳易琺袋崗齡辱洼于鉻帛第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體3、可以定向地克隆DNA片段 克隆在M13 RF DNA分子上的雙鏈DNA片段，

54、到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時分離分子中的雙鏈，則需要兩種獨立的克隆。根據(jù)M13的生物學特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源克隆時的取向。這樣一來，為分別分離外源分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)。 胃洼俯貌甩月鑿崩畦倉紉臭求迄車厚項兌抱殘率面除寓篡廳桅梅娥繃龐程第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體M13mp18 MCS M13mp19 MCSEcoRI BamHI HindIII PstI BglI BglI Ps

55、tI HindIII BamHI EcoRI B P P BB P B P P BBamHI & PstI鉗絢黎番炒導綁犧鴕蒂禁廣踩倉差魯蝦褥茂粱構(gòu)孕眠茅茶咱竹售宅坐僳補第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體噬菌體展示技術(shù)是將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達并展示在噬菌體表面，同時將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，這使得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機的連結(jié)在一起。 五、噬菌體展示技術(shù)余簽扭燕燕斤言規(guī)贅翰勛軍往榔生淵堡奢腥逆莉肖腕獻涸毖瞄擱假咀扇瀕第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體非展示系統(tǒng) 展示系統(tǒng)喂響在照斡消瘓跪訛旦云嗆羊即讒袋樣煌除獸韌嘻錐摸疚嶺機置搜證誨蔑第

56、五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體（一）噬菌體展示技術(shù)的原理M13、fd顆粒的一端表面存在35拷貝的基因編碼的蛋白質(zhì)LeadM13基因III隨機多肽區(qū)領(lǐng)盜遍習段率邵毀靠沿鎂梭囑現(xiàn)敗爵昨瘧串重斯伸靡挺姑墅吁漿垂凱狀狄第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表達型醋落倡梅竟臃鼠渴峰睫智癌喬柴晤韌椽縮場脂尤芹磚練淫指酉沏潑掂避迷第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體Solid phase selection with immunotubes BBBBBBvcoated withsteptavidin a

57、nd biotinylated antigenB繕抵肺頸蔚險信澄諸鉆衣芹毗姐醫(yī)哺榨子煮材臍綿烴硬晦痰賒思研俺掇繼第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體biotin antigenSolution phase selection with biotinylated antigen 狄辱姥末鎢酣遇栽鈔鏈瑞腔踞燙蔭各茫挪慨翔蒂隴摳礫韌場俯壹綻夸膝滾第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體Bind to Streptavidincoated microtitre wells坷瑞夸耳距猖空娛魂夷蔚伺斗亥違知居師子啟籍稍彬幽鄰立夫蛋傻水蘆婦第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載

58、體和柯斯載體Wash to remove unbound phage particles.帖神宇香庚槽漂窘襟拳腮韻肯籬尤萊湛學工泌焰銑弦竅夷兇魔涕杯縷饋鴦第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體Elute bound phage企爍薊簿傀或靛蓑憎孕蕊蓑圈豹屁革軋慎蚜紛枷費勿染臨孟晨峰諷曬狐途第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea) ELISAb) Specificityc) Sequencingd) Affinitye) ActivityE.coli感染和擴增二、噬菌體抗體庫展示技

59、術(shù)back咸織抽罷屠番殺抽齡庶傾妥婿停索祭誤探姨高氣丸撣嘗舔幸奸通團頸炳繹第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體第五節(jié) 噬菌粒載體（phagemid）一、概念 由質(zhì)粒載體和單鏈噬菌體載體結(jié)合而成的新型的載體系列。具有質(zhì)粒的復制起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在；具有單鏈噬菌體的復制起點，在輔助噬菌體幫助下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。榜鵑嶺獄摸哭鑄鈴唁堿疇褒遞俏觸勺饞位私器嘴笨鯨寸舟驕摔偷雅伸蓋宜第五章噬菌體載體和柯斯載體第五章噬菌體載體和柯斯載體 噬菌粒的特點比M13小，約為3000bp，易于體外操作，可以克隆10kb外源兩種復制方式可以得到直接用于測序的單鏈結(jié)構(gòu)