第五章植物病原病毒上一節(jié)小結(jié)1.植物病毒的分類工作由國際病毒分類委員會(huì)（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）植物病毒分會(huì)負(fù)責(zé)。2.植物病毒分類的5個(gè)依據(jù)。3.植物病毒和類病毒的分類單元（目、科、亞科、屬、種）。4.植物病毒的命名：寄主俗名+癥狀特點(diǎn)+病毒5.植物病毒分為五個(gè)大類群。植物病毒概述植物病毒分類與命名植物病原病毒的主要類群植物病毒的鑒定第三節(jié)植物病毒的鑒定

生物學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)電子顯微鏡觀察血清學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)診斷和鑒定的含義植物病毒鑒定：通過一系列的的實(shí)驗(yàn)測(cè)定，根據(jù)病毒的生物學(xué)特性、理化特性、基因組特性和血清學(xué)特性等來確定病毒種類。包含病害診斷和性狀描述兩個(gè)過程。病害診斷：是對(duì)病植物體及其粗提液所作的直觀考察和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，診斷的目的在于確定供診對(duì)象是不是病毒病，是不是和目前已知的某種病毒相同。性狀描述：是對(duì)提純病毒的理化特性及其蛋白質(zhì)與核酸組分所作的檢測(cè)研究，鑒定的目的在于進(jìn)一步確定病毒的種類。一、為何鑒定？造成的問題糧食安全。品種更替。社會(huì)穩(wěn)定?？拊盏巨r(nóng)－－水稻“非典”的肆虐！面對(duì)南方水稻黑條矮縮病新病害，農(nóng)民的無助與無奈，常導(dǎo)致上訪問題突出。謝聯(lián)輝院士、李毅教授和吳祖建研究員在霞浦水稻病毒病發(fā)生現(xiàn)場(chǎng)培訓(xùn)全國植保系統(tǒng)人員。二、如何鑒定？（一）病害診斷：

標(biāo)本診斷和田間診斷1.病毒病與真菌、細(xì)菌、線蟲等傳染性病害的區(qū)別植物病毒病的病部表面沒有肉眼可見的病征，如真菌的霉?fàn)钗?、粉狀物、銹狀物、棉絮狀物、顆粒狀物、菌核、菌索或細(xì)菌的菌膿等。(1)與真菌、細(xì)菌病害的區(qū)別病毒病和線蟲病都可引起植株矮縮、黃化或畸形，病部表面也無病征，但光學(xué)顯微鏡下病毒病的寄主細(xì)胞有時(shí)可見特定的內(nèi)含體，或特定的顯色反應(yīng)，而線蟲病可在病部、蟲癭或根結(jié)內(nèi)查到病原線蟲。例如TMV在光學(xué)顯微鏡下可見六角形晶體狀內(nèi)含體。(2)與線蟲病害的區(qū)別

內(nèi)含體一般地，植原體病害可產(chǎn)生特有癥狀如黃化、叢生、花變?nèi)~或變綠等，電鏡下可見到菌體。對(duì)四環(huán)素等敏感。(3)與植原體病害和難培養(yǎng)細(xì)菌所致病害的區(qū)別2.與生理性病害的區(qū)別獨(dú)特性分散性系統(tǒng)性五性傳染性鮮明性分散性系統(tǒng)性傳染性鮮明性特征性蠟狀脈腫是什么病毒?。开?dú)特癥狀葉色綠/暗綠葉背、葉鞘有條狀突起葉背、葉鞘有線狀脈腫葉背、葉鞘有小瘤狀突起葉片無虛線狀條點(diǎn)葉片有虛線狀條點(diǎn)葉片有條紋，心葉有斷續(xù)條斑/捻轉(zhuǎn)黑條矮縮瘤矮齒矮矮縮簇矮條紋葉枯葉色黃/淺黃葉片、葉鞘淺黃，葉片短窄，間有褐斑葉片黃化，葉鞘綠色草矮黃葉東格魯株形松散株形緊湊特征癥狀類型花葉環(huán)斑畸形變色壞死花葉類型花葉環(huán)斑環(huán)斑環(huán)紋線紋畸形變色壞死（二）實(shí)驗(yàn)診斷生物學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)電子顯微鏡觀察血清學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)(FromAgrios’PlantPathology,3rded.)CoatproteinRNAorDNASerological(ELISA)Detection:Virusstructureandcompositionandthestrategiesinvirusdetection，病毒的結(jié)構(gòu)和成分及檢測(cè)策略Molecular(PCR)StrategiesinPlantVirusDetection

植物病毒檢測(cè)策略RNAorDNACoatprotein1.生物學(xué)實(shí)驗(yàn)—枯斑寄主、過濾寄主和專化介體如煙草花葉病毒在心葉煙上表現(xiàn)局部枯斑。傳播方式汁液（接觸）傳染介體生物傳染種子和花粉傳染生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是植物病毒研究工作的基本環(huán)節(jié)，是準(zhǔn)確診斷鑒定病毒的關(guān)鍵。因?yàn)樽匀徊≈晖⒎侵粠б环N病毒，因此參照柯赫法則的要求分離毒源是必要的。（1）柯赫法則？（2）鑒于病毒不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，應(yīng)用柯赫法則時(shí)要作相應(yīng)的修訂。修訂后可作如下表示：⒈某種病毒必須經(jīng)常與某種病害聯(lián)系在一起；⒉這種病毒必須能從發(fā)病的寄主植物上分離到—利用生物學(xué)方法或理化方法，甩開非致病病原和其它污染物，分離出致病病毒；⒊將這種致病病毒接種到健康寄主上，能再現(xiàn)原來同種病害的癥狀特征；⒋從接種發(fā)病的植物上，能檢測(cè)到這種病毒，并能再次分離到這種病毒?？莅呒闹魇侵甘艿侥撤N病毒感染時(shí)只產(chǎn)生局部枯斑的寄主，一個(gè)局部枯斑就是個(gè)侵染點(diǎn)。過濾寄主是利用寄主對(duì)不同病毒的抗性差異將病毒分離開來。?；轶w是利用介體種間對(duì)病毒親和力和傳毒特性的差異來分離病毒。例如，煙草花葉病毒（TMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）在普通煙和番茄上的混合侵染；馬鈴薯X病毒（PVX）和馬鈴薯Y病毒（PVY）在馬鈴薯上的混合侵染；水稻簇矮病毒（RBSV）和水稻矮縮病毒（RDV）在同一稻株上混合侵染如何分離？（1）鑒別寄主診斷鑒別寄主：用來鑒別病毒或其株系的具有待定反應(yīng)的植物。組合使用的幾種或一套鑒別寄主稱為鑒別寄主譜。鑒別寄主譜中一般包括可系統(tǒng)侵柒的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。摩擦接種（2）介體傳毒昆蟲：蚜蟲、葉蟬、飛虱、粉虱螨類線蟲真菌菟絲子弄清介體種類及其傳毒特性增殖、經(jīng)卵黑尾葉蟬（3種）電光葉蟬RDV否（非循回）RGDVRTV增殖、不經(jīng)卵黑尾葉蟬（2-3種）RYSV(RTYV)RBSV葉蟬類葉蟬傳病毒病增殖、經(jīng)卵灰飛虱增殖、不經(jīng)卵RBSDV增殖、不經(jīng)卵褐飛虱RRSVRGSV飛虱類RSV增殖、不經(jīng)卵白背飛虱SRBSDV褐飛虱傳病毒病水稻鋸齒葉矮縮病水稻草狀矮化病灰飛虱傳病毒病水稻黑條矮縮病水稻條紋葉枯病白背飛虱傳病毒病南方水稻黑條矮縮病生物學(xué)實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，反應(yīng)靈敏，只需少量毒源材料。缺點(diǎn)：工作量大，鑒別寄主需隔離，費(fèi)時(shí)，癥狀受外界條件影響大。2.電子顯微鏡觀察電子顯微鏡負(fù)染：通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外圍的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。超薄切片：將樣品經(jīng)固定、脫水、包埋、聚合和超薄切片和用染色劑染色，電鏡觀察。

免疫電鏡技術(shù)：是免疫學(xué)和電鏡技術(shù)的結(jié)合。該技術(shù)將免疫學(xué)中抗原抗體反應(yīng)的特異性與電鏡的高分辨能力和放大本領(lǐng)結(jié)合在一起，可以區(qū)別出形態(tài)相似的不同病毒。透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡負(fù)染制樣的電鏡照片BYMV負(fù)染電鏡照片TMV負(fù)染電鏡照片CarMV負(fù)染電鏡照片負(fù)染制樣的電鏡照片水稻黃矮病超薄切片電鏡照片CarMV超薄切片電鏡照片BYMV超薄切片電鏡照片免疫電鏡技術(shù)TMV免疫電鏡照片核內(nèi)含體核質(zhì)內(nèi)含體一般是由蛋白或病毒粒體構(gòu)成的晶體結(jié)構(gòu)，少有纖維狀的內(nèi)含體(只有在電子顯微鏡下才能看到)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體在形狀、大小、組成和結(jié)構(gòu)方面差異很大，主要分為不定形內(nèi)含體、假晶體、晶體內(nèi)含體和風(fēng)輪狀內(nèi)含體等五種類型（光學(xué)顯微鏡下可見）。優(yōu)點(diǎn)：⑴快速簡(jiǎn)便，半小時(shí)內(nèi)可制備好，待鏡檢用；⑵可用于各種樣本，如植物粗汁液和各種提純液等；⑶樣品用量極少；⑷有較好的超微結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：負(fù)染效果受染色方法和操作技術(shù)的影響大，要注意條件和積累經(jīng)驗(yàn)。

3.血清學(xué)技術(shù)利用植物病毒衣殼蛋白的抗原特性，制備病毒特異性的抗血清，進(jìn)行病毒抗原和抗血清的特異性免疫學(xué)反應(yīng)。瓊脂雙擴(kuò)散法：在一定濃度的瓊脂凝膠中，抗體和抗原互相擴(kuò)散，在適當(dāng)?shù)奈恢眯纬沙恋?；沉淀線的形狀說明抗原和抗體的相互關(guān)系。酶聯(lián)免疫吸附（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA）法：該方法利用了酶的放大作用，使免疫檢測(cè)的靈敏度大大提高。瓊脂雙擴(kuò)散法

酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)案例：南方水稻黑條矮縮病的血清學(xué)檢測(cè)我國稻飛虱的初始蟲源區(qū)在“緬老越走廊”，此乃東亞稻區(qū)稻飛虱跨境監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)地區(qū)而“滇黔桂三角”是國內(nèi)實(shí)行源頭治理的主攻區(qū)，嶺南區(qū)（湘粵閩三角）則是源頭治理的輔區(qū)。核心問題：白背飛虱數(shù)量與帶毒率海南？雷州半島？海南和廣東的白背飛虱對(duì)福建的影響？飛虱的高效繁殖使本地蟲口數(shù)量快速增長病株和白背飛虱帶毒率檢測(cè)方法dsRNA提取和鑒定RT-PCR擴(kuò)增ELISA免疫膠體金檢測(cè)試紙條斑點(diǎn)免疫檢測(cè)ELISA檢測(cè)膠體金免疫檢測(cè)試紙條福州RBSDV樣品公安SRBSDV樣品孝感SRBSDV樣品福州SRBSDV樣品dsRNA提取和鑒定斑點(diǎn)免疫檢測(cè)RT-PCR檢測(cè)（1）酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）：檢測(cè)病株或白背飛虱帶毒率直接ELISA間接ELISA雙抗夾心ELISA酶標(biāo)板Solidphase=12孔、48孔、96孔空白陰性陽性√1.包被抗體，1小時(shí)洗板3次

√2.封閉，0.5小時(shí)洗板3次

3.加樣品，45分鐘洗板3次每只白背飛虱一個(gè)搓管，樣品處理控制在20分鐘完成

4.加酶標(biāo)記抗體，45分鐘洗板3次

EEEE5.加底物6.15-30分鐘,測(cè)定吸光值或觀察顏色變化ColourlessENZYMEODCONCENTRATION一步法ELISA檢測(cè)白背飛虱帶毒率√2.封閉，0.5小時(shí)洗板3次

3.加樣品和酶標(biāo)記抗體，45分鐘洗板3次每只白背飛虱一個(gè)搓管，樣品處理控制在20分鐘完成

EEEE√1.包被抗體，1小時(shí)洗板3次

4.加底物，顯色15分鐘，直接肉眼觀察判斷結(jié)果（2）免疫膠體金檢測(cè)試紙條：快速檢測(cè)田間病株樣品膠體金試紙條的結(jié)構(gòu)

－－六部分組成樣品墊（）（）膠體金墊（金標(biāo)抗病毒抗體）硝酸纖維素膜背膠紙吸水紙塑料底板背膠紙背膠紙MAX線檢測(cè)線（兔抗病毒抗體）質(zhì)控線（羊抗兔抗體）背膠紙雙抗體夾心原理病毒Y1-病毒-Y2Y1=兔抗病毒多抗Y2=兔抗病毒多抗Y3=羊抗兔二抗質(zhì)控線檢測(cè)線硝酸纖維素膜代替酶聯(lián)板，水稻葉片或根0.5克，5-15分鐘出檢測(cè)結(jié)果（3）斑點(diǎn)免疫檢測(cè)：檢測(cè)病株或白背飛虱帶毒率白背飛虱帶毒率檢測(cè)流程圖將樣品滴在NC膜上，室溫涼干5％脫脂奶粉（37℃封閉，15min）酶標(biāo)抗體HRP（37℃，45min

）PBST洗滌加入底物溶液顯色（37℃，20min）每只白背飛虱一個(gè)搓管，樣品處理控制在20分鐘完成空白陰性陽性抗原的最大稀釋倍數(shù)111222333444說明：1號(hào)樣品稀釋濃度：0.05g+1ml包被液；

2號(hào)樣品稀釋濃度：0.05g+2ml包被液；

3號(hào)樣品稀釋濃度：0.05g+4ml包被液；

4號(hào)樣品稀釋濃度：0.05g+8ml包被液；ss7-3200×ss7-6400×ss7-12800×結(jié)論：樣品稀釋倍數(shù)≥40時(shí)，抗體檢測(cè)病株效果不好，而與抗體稀釋倍數(shù)無關(guān)。DIBA方法在雜交膜上檢測(cè)帶毒白背飛虱結(jié)果白背飛虱帶毒率監(jiān)測(cè)點(diǎn)監(jiān)測(cè)地點(diǎn)與時(shí)間：新羅、長汀、永安、寧化、武夷山、浦城、順昌、霞浦、仙游、同安、福清、南靖4月10日、20日；5月5日、15日、25日；6月5日、15日、25日；7月5日、15日、25日；8月5日、15日。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：靈敏（可測(cè)出1－10ng/ml的濃度）、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單可重復(fù)性強(qiáng)缺點(diǎn)：假陽性反應(yīng)和需要大量高純度的特異性抗血清（設(shè)置對(duì)照;

（掌握合適的工作濃度;

（抗血清的制備及抗血清保存問題）

4.分子生物學(xué)技術(shù)PCR技術(shù)核酸雜交大多數(shù)植物病毒基因組為RNA，而TaqDNA聚合酶不能以RNA為模板合成DNA鏈，這就需要首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成互補(bǔ)的第一鏈DNA，之后才能進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，這一技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（ReversetranscriptionPCR，簡(jiǎn)稱RT-PCR）。（1）PCR技術(shù)PCR原理檢測(cè)結(jié)果（2）核酸雜交原理：DNA—RNA堿基互補(bǔ)關(guān)系。雜交：DNA—RNA形成異質(zhì)雙鏈的過程。利用根據(jù)已知序列合成或制備的核苷酸片斷—探針（probe）是否能與待測(cè)核酸雜交，判斷與已知片斷是否有同源性。Southernblotting檢測(cè)結(jié)果M為凝膠電泳時(shí)的Marker，1為陽性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，從3-11泳道分別是樣品LC1、LC1、BT1、FQ1、PT1、XT1、LJ1、MH1、YZ1

斑點(diǎn)印跡法檢測(cè)結(jié)果：（1）廈門同安區(qū)3月29日至4月10日燈下白背飛虱樣品，共31頭，其中2頭帶毒，帶毒率為6.45%；實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的白背飛虱檢測(cè)12頭，不帶病毒；實(shí)驗(yàn)室條件下，在水稻病株上飼毒后度過循回期的白背飛虱檢測(cè)21頭，有19頭獲毒，帶毒率為90.47%。

DetectiontoaPanelofTomatoVirusesusingIC-qRT-PCR,使用免疫捕捉定量RT-PCR來檢測(cè)一系列的番茄病毒5.病毒檢測(cè)新技術(shù)N.benthamianaN.tobacumS.melongenaS.lycopersicumATomatoDiseasewithUnknownEtiology,番茄病病因不明Next-GenSequencingforPlantVirus/ViroidIdentification

新一代測(cè)序的植物病毒/類病毒識(shí)別HostRNAtemplateNGStechnologyReferenceTomato番茄&Gomphrena,千日紅TotalplantRNARoche454Adamsetal.,2009Grapevine葡萄TotalplantRNA&dsRNARoche454AlRwahnihetal.2009Grapevine葡萄dsRNAIlluminaCoetzeeetal.2010Sweetpotato甘薯sRNAIlluminaKreuzeetal.,2009Grapevine葡萄sRNAIlluminaNavarroetal.,2009Tomato番茄,Squash西葫蘆sRNAIlluminaHagenetal.,2011Tomato番茄sRNAIlluminaLietal.,2012