鹽酸水蘇堿對小鼠乳腺炎的防治效果研究,獸醫(yī)碩士論文乳房炎是導致牛奶質(zhì)量和產(chǎn)量大幅下降的原因，給奶業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近幾十年來，非甾體抗炎藥〔NSAIDs〕和抗生素作為常規(guī)藥物治療乳房炎。然而，抗生素耐藥性已經(jīng)成為主要的公共威脅之一。中藥相比抗生從來講具有天然、安全、副作用小等特點，可減少藥物殘留和耐受現(xiàn)象的出現(xiàn)。已有報道稱中藥提取物鹽酸水蘇堿具有抗炎抗氧化等活性，然而其對乳腺炎能否具有保衛(wèi)作用還尚未見到報道。因而本研究以鹽酸水蘇堿為研究對象，進行了急性毒性試驗和體外抑菌試驗，并通過構(gòu)建LPS誘發(fā)的小鼠乳腺炎模型來評價其對乳腺炎的防治效果，為其進一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。本研究采用小鼠急性毒性實驗方式方法，討論鹽酸水蘇堿小鼠腹腔給藥的安全性，進行鹽酸水蘇堿對小鼠腹腔注射給藥的半數(shù)致死量〔LD50〕測定，連續(xù)觀察7d。同時，采用瓊脂稀釋法檢測最小抑菌濃度〔MIC〕研究了鹽酸水蘇堿對乳腺炎常見病原體大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。建立LPS誘發(fā)的小鼠乳腺炎模型，觀察其大體解剖學變化，通過HE染色方式方法檢測乳腺組織的病理組織學變化，利用試劑盒檢測乳腺組織中MPO活性以及氧化應激指標T-SOD、GSH、MDA、NO的水平，利用酶聯(lián)免疫吸附測定〔Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA〕試劑盒檢測血清炎細胞因子TNF-、IL-1和IL-6的蛋白水平。安全性結(jié)果顯示，鹽酸水蘇堿的LD50劑量為1565.442mg/kg，其95%可信區(qū)間為1440.781~1711.356mg/kg，存活小鼠解剖觀察心臟、肝臟、腎臟、脾、腸道等無無明顯病理變化。體外抑菌試驗結(jié)果表示清楚鹽酸水蘇堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為10mg/kg。鹽酸水蘇堿對小鼠乳腺炎保衛(wèi)作用試驗結(jié)果顯示，鹽酸水蘇堿改善了乳腺炎造成的乳腺組織充血壞死以及乳汁蓄積狀況，使腺泡壁變薄，炎性浸潤減少，降低了MPO活性及促炎因子IL-1、IL-6和TNF-的表示出水平，同時顯著升高了T-SOD、GSH含量，降低了MDA和NO的含量。綜上所述，鹽酸水蘇堿有一定毒性并具有抑菌活性，能夠通過降低促炎因子水平、提高抗氧化能力來發(fā)揮對小鼠乳腺炎的保衛(wèi)作用。本文關(guān)鍵詞語：鹽酸水蘇堿；急性毒性；抑菌；乳腺炎；抗炎；抗氧化。ABSTRACTMastitisisthecauseofsignificantdeclineinmilkqualityandproduction,andhasbroughtseriouseconomiclosstothedairyindustry.Inrecentdecades,non-steroidalanti-inflammatorydrugs(NSAIDs)andantibioticshavebeenusedforthetreatmentofmastitisasconventionaldrugtherapy.However,antibioticresistancehasbecomeoneofthemajorpublichealththreats.Comparedwithantibiotics,traditionalChinesemedicinehasthefeatureslikenatural,safe,lesssideeffects,etc.,whichcanreducetheoccurrenceofdrugresidueandtolerance.Ithasbeenreportedthatstachydrinehydrochloride,theextractoftraditionalChinesemedicine,hasanti-inflammatoryandanti-oxidantactivities,butwhetherithasaprotectiveeffectonmastitishasnotbeenreported.Therefore,inthisexperiment,stachydrinehydrochloridewasusedastheresearchobjecttostudyitssafetyandantibacterialeffectthroughtoxicologicaltestandinvitrobacteriostasistest,andtoexploreitsprotectiveeffectonmastitisinmicebyconstructingamousemastitismodelinducedbyLPS,inordertoprovidedatareferenceforthefurtherdevelopmentandutilizationofstachydrinehydrochloride.Inthisstudy,theacutetoxicitytestmethodofmicewasusedtoexplorethesafetyofintraperitonealadministrationofstachyinehydrochlorideinmice,andthemedianlethaldose(LD50)wasdeterminedafter7consecutivedays.Theminimuminhibitoryconcentration(MIC)wastestedbyagardilutionmethodtostudytheantibacterialeffectofstachyinehydrochlorideonEscherichiacoliandStaphylococcusaureus,commonpathogensofmastitis.AmodelofLPS-inducedmousemastitiswasestablishedtoobserveitsgeneralanatomicalchanges.BesidesthehistopathologicalchangesofbreasttissuewasobservedbyHEstainingmethod,theMPOactivityandlevelsofoxidativestressindicatorsT-SOD,GSH,MDAandNOinbreasttissueweredetected,andthelevelsofseruminflammatorycytokinesTNF-,IL-1andIL-6weredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)kits.ResultsoftheacutetoxicitytestshowedthattheLD50doseofstachyinehydrochloridewas15654.42mg/kg,andits95%confidenceintervalwas1440.781~1711.356mg/kg.Survivingmiceweredissectedtoobserveheart,liver,kidney,spleen,intestineandnoobviouspathologicalchangeswasobserved.TheresultsofbacteriostasistestsinvitroshowedthattheMICofstachyinehydrochlorideagainstEscherichiacoliandStaphylococcusaureuswereboth10mg/kg.Thetestresultsoftheprotectiveeffectofstachylaminehydrochlorideonmastitisinmiceshowedthatstachylaminehydrochlorideimprovedthecongestionandnecrosisofbreasttissueandmilkaccumulationcausedbymastitis,thinnedtheacinarwall,reducedtheinflammatoryinfiltration,theMPOactivity,andtheexpressionlevelsofpro-inflammatoryfactorsIL-1,IL-6andTNF-,significantlyincreasedthelevelsofT-SODandGSH,andreducedthelevelsofMDAandNO.Insummary,stachyinehydrochloridehassometoxicityandhasbacteriostaticactivity.Itcanplayaprotectiveroleinmastitismicebyreducingthelevelofpro-inflammatoryfactorsandimprovingantioxidantcapacity.Keywords:stachydrinehydrochloride;acutetoxicity;bacteriostatic;mastitis;anti-inflammatory;oxidationresistance。文獻綜述1、奶牛乳腺炎的研究進展。奶牛因病原微生物入侵、機械損傷和物理化學等刺激而導致乳房本質(zhì)和間質(zhì)發(fā)生的炎性變化稱為奶牛乳腺炎，其特點是感染部位的免疫細胞募集增加了體細胞計數(shù)〔SCC〕，斷裂的乳腺上皮細胞〔MEC〕嚴密連接增加了牛奶中的鈉含量[1]，產(chǎn)奶量減少，全世界每年因乳腺炎導致的損失高達幾百億美元，已被以為是奶業(yè)最嚴重、最昂貴的疾病之一。由于太多的細菌刺激引起的乳腺炎有多種形式[2]，從急性臨床性乳腺炎到慢性亞臨床性乳腺炎。臨床型乳房炎會導致乳腺腫脹、發(fā)紅和發(fā)熱，并伴有血管擴張，對患畜來講通常是痛苦的，而隱性乳房炎通常沒有異常感覺和狀態(tài)，但最終仍會導致產(chǎn)奶量減少。對于具有明顯臨床異常感覺和狀態(tài)的臨床型乳腺炎較容易診斷，可及早給出治療，而隱性乳腺炎由于缺乏典型病癥，較難診斷，需要實驗室診斷來分離和鑒定所牽涉的病原體，而患病奶牛哺乳期甚至一生都會感染或威脅生命。固然有的奶牛仍然能夠產(chǎn)奶，但牛奶的品質(zhì)及產(chǎn)量均遭到影響，作為食源性產(chǎn)品的牛奶，產(chǎn)品產(chǎn)量及質(zhì)量與人們的生活和身體健康息息相關(guān)，并且宏大的經(jīng)濟損失也嚴重限制了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，華而不實78%的經(jīng)濟損失是由于牛奶產(chǎn)量減少，另外8%的經(jīng)濟損失來源于治療費用，剩余14%的經(jīng)濟損失來源于撲殺[3]。在乳腺炎被人類認識的上百年來，科學家們一直不斷研究，我們國家認識該病時間較晚，雖有一定的研究但并沒有完好徹底解決該病發(fā)生與治療?，F(xiàn)今我們國家仍然以抗生素為主要治療原則，而抗生素所引起的細菌耐藥性是生產(chǎn)經(jīng)過及往后治療的一大障礙，牛奶中會存留抗生素殘留物，這對消費者的健康是有害的，這些年來，抗生素這種常規(guī)治療方式方法似乎顯得緩慢而缺乏[4]。因而，我們?nèi)砸ふ野踩咝У乃幬飦矸乐鼓膛Ｈ橄傺?，保證養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)步發(fā)展，提高人民生活水平。1.1、奶牛乳腺炎病因。乳腺炎的發(fā)生因素極其復雜，包括入侵的病原體和宿主因素，如哺乳期、年齡、奶牛的免疫狀態(tài)、遺傳和營養(yǎng)狀況、動物本身的應激、環(huán)境因素、飼養(yǎng)管理等互相作用，而奶牛乳腺炎發(fā)生的主要因素是病原微生物的感染[5]，臨床上現(xiàn)已分離鑒定出130余種可導致乳腺炎的致病菌[6]。傳染性致病菌多由擠奶操作不規(guī)范引起傳播，致病菌定植于乳腺上皮細胞或吞噬細胞中，引起無明顯異常感覺和狀態(tài)的乳腺炎并逐步發(fā)展成慢性乳腺炎[7]，以大腸桿菌為主的環(huán)境性致病菌所引起的乳腺炎通常具有明顯的全身異常感覺和狀態(tài)，這些致病菌通常隱藏在奶牛皮膚的褶皺中，通過開放的乳導管進入乳腺中繁衍，從生理和經(jīng)濟角度看，細菌性乳腺炎是最常見和最重要的[2]。因而，對下面三種主要引起感染的病原菌作了簡單介紹。1.1.1、金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌〔Staphylococcusaureus,S.aureus〕為革蘭氏陽性兼性厭氧菌，可通過乳導管進入乳腺并爆發(fā)性感染，通常在6小時內(nèi)就會引起乳區(qū)急性壞疽使乳腺壞死，嚴重可能導致敗血癥威脅生命[8]。由于其容易傳播，流行迅速，菌株變異快，擅長逃避宿主免疫系統(tǒng)，除奶牛本身會感染發(fā)病外，金黃色葡萄球菌還會隨著乳汁分泌感染其他奶牛[9]。金黃色葡萄球菌菌體構(gòu)造復雜，包括多種毒素和侵襲性酶，細菌在莢膜多糖的抗吞噬作用下不被吞噬細胞吞噬，利用粘附素在乳腺上皮細胞和吞噬細胞中定植，進一步產(chǎn)生毒素和酶毀壞宿主細胞，使得感染難以控制[10]。另外，從公共衛(wèi)生角度看，作為人獸共患菌，若乳制品含菌量超標，將嚴重影響人們的健康安全。1.1.2、大腸桿菌。大腸桿菌〔Escherichiacoli,E.coli〕是革蘭氏陰性菌，在牛群里廣泛分布，該菌除從乳導管感染外，也會通過損傷的生殖道進入血循環(huán)或淋巴感染乳區(qū)[11]，大腸桿菌釋放細菌細胞壁成分脂多糖〔LPS〕，誘導局部炎癥介質(zhì)顯著增加，具有強烈的全身急性時相反響。越來越多的證據(jù)表示清楚，LPS是最有效的觸發(fā)炎癥反響的微生物啟動者，通過乳腺上皮細胞凋亡來減少產(chǎn)奶量，并增加牛奶體細胞計數(shù)〔SCC〕。有研究表示清楚[12]，乳房內(nèi)免疫反響可能是由革蘭氏陰性菌誘導的Toll樣受體〔TLR〕信號轉(zhuǎn)導引起。除了乳房炎的高炎癥反響外，持續(xù)或過度的炎癥還會誘導內(nèi)皮細胞凋亡，可能導致組織損傷甚至死亡[13]。1.1.3、鏈球菌。鏈球菌有很多分類，華而不實以無乳鏈球菌為主要致病菌，無乳鏈球菌〔Streptococcusagalactiae，GBS〕革蘭染色呈陽性，是具有高度傳染性的專一乳腺內(nèi)寄生菌，奶牛感染后通常無明顯臨床異常感覺和狀態(tài)，一般不會引起乳腺