卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)研究第1頁/共34頁一發(fā)展背景二試驗(yàn)內(nèi)容三結(jié)果與分析四總結(jié)第2頁/共34頁3一發(fā)展背景第3頁/共34頁

隨著胚胎工程技術(shù)的深入研究和商業(yè)性胚胎移植技術(shù)的發(fā)展，胚胎需求量日益增加，單純依靠超數(shù)排卵獲得體內(nèi)胚的方法成本高、采胚數(shù)量有限，不能滿足科研和生產(chǎn)的需要。卵母細(xì)胞體外胚生產(chǎn)體系的建立將成為胚胎生產(chǎn)的主要突破點(diǎn)。深入研究卵母細(xì)胞體外胚及其冷凍保存的技術(shù)機(jī)理，建立一套完全在體外培養(yǎng)條件下快速生產(chǎn)和保存胚胎的技術(shù)體系，挖掘優(yōu)良母畜的繁殖潛力，具有巨大的科研價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義第4頁/共34頁5牛胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的累積效率低、技術(shù)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件高，受培養(yǎng)基、卵泡液、共培養(yǎng)細(xì)胞等因素影響大，還缺乏統(tǒng)一的理論依據(jù)和程序化的標(biāo)準(zhǔn)方案，仍處于探索階段。因此，還必須不斷改進(jìn)和完善胚胎體外培養(yǎng)和生產(chǎn)體系第5頁/共34頁6二試驗(yàn)內(nèi)容第6頁/共34頁7試驗(yàn)內(nèi)容…技術(shù)路線種公牛鮮精凍精洗滌、離心精子獲能母牛超排卵巢采卵IVMIVFIVC桑、囊胚COCs第7頁/共34頁8試驗(yàn)內(nèi)容…試驗(yàn)設(shè)計(jì)1卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)1.1COCs級(jí)別對卵母細(xì)胞成熟的影響1.2卵泡直徑對卵母細(xì)胞成熟的影響2卵母細(xì)胞體外受精2.1不同離心方法對精子獲能和卵母細(xì)胞受精的影響2.2不同上浮方法對精子獲能和卵母細(xì)胞受精的影響2.3精子濃度對卵母細(xì)胞受精的影響第8頁/共34頁93胚胎體外培養(yǎng)3.1共培養(yǎng)體系對胚胎發(fā)育的影響3.2培養(yǎng)液體積對胚胎發(fā)育的影響4冷凍保存COCs的培養(yǎng)4.1GL和EG一步法冷凍對COCs的影響4.2麥管和OPS管玻璃化冷凍對COCs的影響SPSS統(tǒng)計(jì)分析第9頁/共34頁10三結(jié)果與分析第10頁/共34頁111卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)

1.1COCs級(jí)別對卵母細(xì)胞成熟的影響選擇A、B級(jí)COCs進(jìn)行成熟培養(yǎng)COCs級(jí)別測定數(shù)成熟數(shù)成熟率%A級(jí)COCs40925563.80a

B級(jí)COCs42719747.80bC級(jí)COCs33982.01c

D級(jí)COCs18600.00dC級(jí)COCs第11頁/共34頁121.2卵泡直徑對卵母細(xì)胞成熟的影響卵母細(xì)胞的成熟率與卵泡直徑關(guān)系密切，在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，宜選擇卵巢發(fā)育正常的卵泡采集，而不宜選擇發(fā)育過大或過小的邊際卵泡卵泡直徑樣本成熟成熟率φ＜2mm64912819.06bφ2～8mm94557861.84a

φ＞8mm1473017.07c

第12頁/共34頁132卵母細(xì)胞體外受精

2.1不同離心法對精子獲能和卵母細(xì)胞受精的影響①二次離心沉淀液：精子活力0.44；獲能效果10min最高為0.41，15min為0.32，超活化以15min時(shí)最好；受精率為40.19%②二次離心上清液：精子活力0.56；獲能效果10min最高0.59，15min時(shí)較低為0.585，超活化也以15min時(shí)最好；受精率為43.21%洗滌精子活力樣本均數(shù)凍精解凍活力200.41c2次離心上清液活力200.56a2次離心沉淀液活力200.44b第13頁/共34頁14從試驗(yàn)結(jié)果看，宜選用上清液15min組的獲能精子進(jìn)行體外受精。本試驗(yàn)突破了精子離心法的傳統(tǒng)方法，避開了單純利用沉淀液進(jìn)行精子獲能的思路，而直接對上清液進(jìn)行離心處理，獲得了理想的精子洗滌和獲能效果精子獲能活力超活化效果第14頁/共34頁152.2不同溫度上浮法對精子獲能和卵母細(xì)胞受精的影響室溫上浮法：

20～24℃室溫。上浮60min，45min活力最高0.68，對其獲能15min后進(jìn)行體外受精，平均受精率41.40%室溫上浮精子活力凍精

0.5000g

上浮15min0.5667c上浮20min0.6200b上浮25min0.5933bc上浮30min0.6100bc上浮35min0.5467df上浮40min0.5900bce上浮45min0.6800a

上浮50min0.6233b上浮55min0.6033bc上浮60min0.5267de第15頁/共34頁16恒溫上浮法：CO2培養(yǎng)箱（38.5℃）上浮60min，30min活力最高0.697，對其獲能15min體外受精，受精率41.51%恒溫上浮精子活力凍精活力

0.4800d上浮15min0.5367c

上浮20min0.5933b上浮25min0.6067b上浮30min0.6967a

上浮35min0.5867b上浮40min0.5300c

上浮45min0.4633d上浮50min0.4367d上浮55min0.4100e上浮60min0.3867e第16頁/共34頁17二種不同上浮方法的精子活力和受精率之間差異不顯著（p＞0.05），恒溫上浮法的效果略高于室溫組。室溫隨著季節(jié)和氣候變化而變化，始終處于不穩(wěn)定狀態(tài)，精子活力升降比較零亂，而恒溫上浮的條件穩(wěn)定，精子活力升降序列比較整齊，在本試驗(yàn)中的優(yōu)勢雖不明顯，如從可控角度考慮，還以恒溫上浮法為宜培養(yǎng)液表.xls項(xiàng)目受精率上清液獲能精子受精率43.21沉淀液獲能精子受精率40.18室溫上浮獲能精子受精率41.40恒溫上浮獲能精子受精率41.50受精率獲能方法與卵母細(xì)胞受精率第17頁/共34頁182.3精子濃度對卵母細(xì)胞受精的影響本試驗(yàn)表明精子適宜濃度宜控制在1.0～1.5×106個(gè)/ml精子濃度樣本COCs卵裂受精率高（300萬/ml）3040213733.9637c

中（150萬/ml）3040319047.3357a低（100萬/ml）3038216242.3837b第18頁/共34頁193胚胎體外培養(yǎng)3.1卵丘細(xì)胞、卵丘細(xì)胞+bFF共培養(yǎng)系統(tǒng)對胚胎發(fā)育的影響處理樣本COCs桑椹胚數(shù)囊胚數(shù)桑椹胚率囊胚率卵丘細(xì)胞組303911133329.0713b8.5063b卵丘細(xì)胞+bFF302421484534.9890a

10.6343a

對照組30308781926.6677c

7.2363c

第19頁/共34頁20卵母細(xì)胞體外胚的發(fā)育受到多種因素的影響，培養(yǎng)過程中要摸擬卵母細(xì)胞或胚胎在子宮中的條件，給細(xì)胞發(fā)育創(chuàng)造良好的環(huán)境。卵母細(xì)胞體外受精過程中明顯存在發(fā)育阻滯，克服發(fā)育阻滯的主要手段是用共培養(yǎng)系統(tǒng)提高卵裂率和桑、囊胚發(fā)育率。本試驗(yàn)通過添加共培養(yǎng)物質(zhì)，較好地克服了體外胚的發(fā)育阻滯第20頁/共34頁21處理樣本COCs桑椹胚數(shù)囊胚數(shù)桑椹胚率囊胚率50μl培養(yǎng)液303771233533.1433b9.0680b500μl培養(yǎng)液303881373836.2260a10.2310a

3.2培養(yǎng)液體積對胚胎發(fā)育的影響第21頁/共34頁22大體積培養(yǎng)液培養(yǎng)的體外胚、桑、囊胚率均較高于微滴培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)液的體積與培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和液體蒸發(fā)有關(guān)。培養(yǎng)液量小，胚胎平衡培養(yǎng)的微環(huán)境差，培養(yǎng)環(huán)境易隨外圍環(huán)境的變化而改變；培養(yǎng)液體積過大，胚胎及細(xì)胞分泌的生長因子濃度降低，不能有效地促進(jìn)胚胎正常發(fā)育第22頁/共34頁234冷凍保存COCs的解凍培養(yǎng)4.1GL和EG一步法冷凍對COCs的影響COCs在液氮保存1周后解凍成熟培養(yǎng)冷凍保護(hù)劑GL和EG均可用于COCs的冷凍保存（p＞0.05），但EG的效果比較好處理冷凍COCs成熟COCs桑椹胚囊胚成熟率桑椹胚率囊胚率GL356118371433.44a

10.56a

3.86a

EG349119381434.46b11.18b4.18b第23頁/共34頁24成熟率桑椹胚率囊胚率第24頁/共34頁254.2麥管和OPS管玻璃化冷凍對COCs的影響以麥管和OPS管作為冷凍載體，二步法玻璃化冷凍COCs。對冷凍1周后的COCs解凍培養(yǎng)OPS管玻璃化冷凍的效果優(yōu)于麥管法（p＞0.05），而麥管法宜于操作和儲(chǔ)存，宜在實(shí)際操作中選用麥管法處理冷凍COCs成熟COCs桑椹胚囊胚成熟率桑椹胚率囊胚率麥管法

347102331229.84a

9.34a

3.47a

OPS法372118361431.89b9.67b3.80b第25頁/共34頁26成熟率桑椹胚率囊胚率第26頁/共34頁274.3COCs冷凍方法的比較COCs的4種處理方法在成熟培養(yǎng)、桑椹胚發(fā)育和囊胚發(fā)育方面的趨勢基本一致，整體效果的優(yōu)勢序列為EG法＞GL法＞OPS管法＞麥管法玻璃化冷凍效果低于程序化一步法冷凍法。由于玻璃化冷凍的解凍處理程序復(fù)雜，建議實(shí)際應(yīng)用時(shí)選用麥管程序化一步法冷凍法處

理COCs成熟率桑椹胚率囊胚率一步法甘

油組33.441310.56233.8610乙二醇組

34.459011.18104.1817平

均33.950110.87164.0213玻璃化法麥

管法29.83779.34433.4700OPS法31.88809.66573.8003平

均30.86289.50503.6351第27頁/共34頁28四總結(jié)第28頁/共34頁291COCs級(jí)別選擇A、B級(jí)COCs進(jìn)行卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)2卵泡大小選擇直徑2～8mm卵泡的COCs進(jìn)行卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)3離心法精子獲能對第一次離心上清液繼續(xù)進(jìn)行低速離心處理，可獲得更好的精子洗滌和獲能效果。低速離心4上浮法精子獲能選用恒溫上浮法進(jìn)行精子洗滌和獲能5獲能精子濃度用于體外受精的適宜精子濃度為1.0～1.5×106個(gè)/ml6共培養(yǎng)系統(tǒng)卵丘細(xì)胞+bFF共培養(yǎng)系統(tǒng)能顯著促進(jìn)體外胚的發(fā)育第29頁/共34頁307培養(yǎng)液體積大體積培養(yǎng)液培養(yǎng)的桑、囊胚率均較高于微滴培養(yǎng)，大體積培養(yǎng)液更有利于胚胎發(fā)育8冷凍COCs解凍培養(yǎng)①冷凍保護(hù)劑EG和GL對COCs有良好的冷凍保存作用，EG效果比GL更好②OPS管玻璃化冷凍效果優(yōu)于麥管法，麥管法宜于操作和儲(chǔ)存，建議在實(shí)際操作中選用麥管法③程序化一步法冷凍COCs的效果優(yōu)于玻璃化冷凍法第30頁/共34頁311卵母細(xì)胞及體外胚培養(yǎng)：選擇2～8mm卵泡的A、B級(jí)COCs，清選后移入500μl成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h；揀取成熟良好卵母細(xì)胞，用上清液二次離心法或恒溫上浮法清選和獲能的精液體外授精8h，在加入卵丘細(xì)胞和bFF的IVC液中繼續(xù)培養(yǎng)120～140h，揀取桑椹胚和囊胚2卵母細(xì)胞的冷凍保存：選擇2～8mm卵泡A、B級(jí)COCs，用以EG為冷凍保護(hù)劑的麥管程序化一步法進(jìn)行冷凍保存3