引物設(shè)計(jì)以基因?yàn)槔斀庋菔疚母瀣F(xiàn)在是1頁\一共有24頁\編輯于星期六優(yōu)選引物設(shè)計(jì)以基因?yàn)槔F(xiàn)在是2頁\一共有24頁\編輯于星期六引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率PARTONE現(xiàn)在是3頁\一共有24頁\編輯于星期六12引物長度一般引物長度為18~30堿基。決定引物熔解溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度。長度越長，Tm值越大。長度過長，退火溫度和延長溫度相差太小，不利于延伸反應(yīng)。長度過短，特異性低GC含量一般為40%~60%，一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴引物設(shè)計(jì)原則現(xiàn)在是4頁\一共有24頁\編輯于星期六3引物自身和引物之間引物自身不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）引物設(shè)計(jì)原則引物之間不能形成二聚體（包括同種引物之間或上游引物與下游引物之間）且引物不能與DNA其他區(qū)域錯(cuò)配現(xiàn)在是5頁\一共有24頁\編輯于星期六引物設(shè)計(jì)原則4引物末端引物3′端：由于延伸從3′端開始，因而不能進(jìn)行任何修飾；同時(shí)不應(yīng)選擇A，因?yàn)锳-A、A-G錯(cuò)配。3’端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)引物5′端：主要限定引物長度，對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大；可以修飾，如添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物亞克隆現(xiàn)在是6頁\一共有24頁\編輯于星期六引物設(shè)計(jì)原則引物5′端修飾技術(shù)附加核酸序列用途

限制酶位點(diǎn)克?。ㄈ缍ㄏ蚩寺。┦删w啟動(dòng)子合成RNA探針、測(cè)序蛋白質(zhì)結(jié)合序列產(chǎn)物純化、檢測(cè)核糖體結(jié)合序列高效表達(dá)加錯(cuò)配堿基造成突變定點(diǎn)誘變5避開靶基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)現(xiàn)在是7頁\一共有24頁\編輯于星期六PARTTWO獲取目的基因利用Genbank數(shù)據(jù)庫搜尋DNA、mRNA或者蛋白質(zhì)序列來設(shè)計(jì)引物現(xiàn)在是8頁\一共有24頁\編輯于星期六獲取目的基因現(xiàn)在是9頁\一共有24頁\編輯于星期六現(xiàn)在是10頁\一共有24頁\編輯于星期六mRNA對(duì)應(yīng)DNA序列蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)編碼區(qū)現(xiàn)在是11頁\一共有24頁\編輯于星期六外顯子對(duì)應(yīng)的DNA序列、基因、編號(hào)現(xiàn)在是12頁\一共有24頁\編輯于星期六單擊CDS后現(xiàn)在是13頁\一共有24頁\編輯于星期六PARTTHREE引物設(shè)計(jì)利用生物軟件和網(wǎng)頁進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)現(xiàn)在是14頁\一共有24頁\編輯于星期六引物設(shè)計(jì)Primerpremier5最常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo7常和PP5聯(lián)用評(píng)估引物NCBIPrimer-blast近幾年NCBI推出的網(wǎng)站現(xiàn)在是15頁\一共有24頁\編輯于星期六現(xiàn)在是16頁\一共有24頁\編輯于星期六此區(qū)域輸入待測(cè)DNA序列現(xiàn)在是17頁\一共有24頁\編輯于星期六現(xiàn)在是18頁\一共有24頁\編輯于星期六現(xiàn)在是19頁\一共有24頁\編輯于星期六現(xiàn)在是20頁\一共有24頁\編輯于星期六現(xiàn)在是21頁\一共有24頁\編輯于星期六上游引物下游引物引物設(shè)計(jì)結(jié)果（一例）引物與DNA結(jié)合情況現(xiàn)在是22頁\一共有24頁\編輯于星期六RT-PCR由于后面要應(yīng)用于RT-PCR，復(fù)制的是cDNA，而cDNA中沒有內(nèi)含子，所以在設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)該用編碼區(qū)結(jié)果：現(xiàn)在是23頁\一共有24頁\編輯于星期六簡并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。簡并引物M--ACS--GCW--ATR--GAY--TCK--GTB--GTCD--GATH