生物化學(xué)核酸2第1頁/共100頁1核酸的化學(xué)

核酸的發(fā)現(xiàn)1869年：Miescher（瑞士）膿細胞核：含磷化合物（核素，nuclein）1889年：Altmann酵母動物細胞：含磷化合物（核酸，nucleicacid）第2頁/共100頁Miescher(Switzerland)

nuclein,18691F.Hoppe-Seyler2

1871,paperpublication(Med.chem.Unters.)31889,R.Altmann(USA):nucleicacid第3頁/共100頁核酸的化學(xué)

核酸的組成基本組分磷酸戊糖（核糖，脫氧核糖）堿基基本組成單位核苷酸（nucleotide）第4頁/共100頁戊糖（核糖/脫氧核糖）第5頁/共100頁堿基嘌呤堿基腺嘌呤鳥嘌呤嘧啶堿基胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶第6頁/共100頁稀有堿基第7頁/共100頁核苷酸（nucleotide）第8頁/共100頁核苷與核苷酸第9頁/共100頁環(huán)核苷酸第10頁/共100頁核苷與核苷酸第11頁/共100頁核酸的化學(xué)

核酸的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)多核苷酸鏈空間結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)DNARNA三級結(jié)構(gòu)、三級以上結(jié)構(gòu)第12頁/共100頁核苷酸的連接第13頁/共100頁磷酸二酯鍵第14頁/共100頁DNA

二級結(jié)構(gòu)1953年Watson&Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)第15頁/共100頁DNA二級結(jié)構(gòu)第16頁/共100頁雙螺旋反向平行堿基對在內(nèi)部穩(wěn)定因素氫鍵堿基堆集力主要參數(shù)螺距：3.4nm堿基對：10bp/匝直徑：2nm第17頁/共100頁堿基配對與氫鍵第18頁/共100頁DNA二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象右手雙螺旋左手雙螺旋第19頁/共100頁DNA二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象第20頁/共100頁DNA三級結(jié)構(gòu)第21頁/共100頁染色體（chromosome）第22頁/共100頁從DNA到核小體

壓縮6—7倍

從DNA到中空螺線管

壓縮約40倍

從DNA到染色體

壓縮8400多倍第23頁/共100頁RNA莖環(huán)與發(fā)夾第24頁/共100頁tRNA二級結(jié)構(gòu)

——三葉草氨基酸臂3’—CCA-OH反密碼環(huán)反密碼子D環(huán)TψC環(huán)附加環(huán)第25頁/共100頁tRNA三級結(jié)構(gòu)第26頁/共100頁2核酸的性質(zhì)

核酸的變性與復(fù)性變性（denature/denaturation）概念：DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象化學(xué)鍵變化：維持雙螺旋穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵發(fā)生斷裂，斷裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化：DNA變性改變了其空間結(jié)構(gòu)，不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變第27頁/共100頁DNA變性DNA的變性因素加熱極端的pH有機試劑（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件第28頁/共100頁DNA變性變性DNA的性質(zhì)變性能導(dǎo)致DNA的一些理化性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變?nèi)芤赫扯冉档腿芤盒庑园l(fā)生改變增色效應(yīng)或高色效應(yīng)第29頁/共100頁溶液粘度降低

DNA雙螺旋是緊密的“剛性”結(jié)構(gòu)，變性后代之以“柔軟”而松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度因此而明顯下降溶液旋光性發(fā)生改變變性后整個DNA分子的對稱性及分子局部的構(gòu)型發(fā)生改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化增色效應(yīng)或高色效應(yīng)（hyperchromiceffect）

DNA變性后，DNA溶液的紫外吸收增強的效應(yīng)變性DNA的性質(zhì)第30頁/共100頁增色效應(yīng)DNA分子在250－280nm波長具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm紫外吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是：DNA分子中堿基間電子的相互作用雙螺旋結(jié)構(gòu)中，有序堆積的堿基“束縛”了這種作用DNA變性后，雙鏈解開，堿基間電子的相互作用更有利于紫外吸收，

故而產(chǎn)生了增色效應(yīng)第31頁/共100頁增色效應(yīng)增色效應(yīng)可以作為DNA變性的指標不同來源DNA的變化不一，如大腸桿菌DNA經(jīng)熱變性后，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同來源的DNA溶液的增值范圍大多在20－30%之間第32頁/共100頁變性溫度熔解溫度（meltingtemperature，Tm）以加熱為變性條件，使DNA分子雙鏈解開50%所需溫度特點爆發(fā)式：熱變性是在變性溫度范圍內(nèi)突發(fā)的躍變過程，很像結(jié)晶達到熔點時的熔化現(xiàn)象，故名熔解溫度狹窄性：變性溫度范圍很小第33頁/共100頁變性溫度取決于DNA自身的性質(zhì)不同來源DNA間的Tm存在差別，在溶劑相同的前提下，這種差別主要是由DNA本身下列兩方面的性質(zhì)所造成的DNA的均一性DNA的（G+C）含量第34頁/共100頁DNA的均一性有二種含義DNA分子中堿基組成的均一性：如人工合成的只含有一種堿基對的多核苷酸片段，與天然DNA比較，其Tm值范圍就較窄。因前者變性時氫鏈斷裂幾乎可“齊同”進行待測DNA樣品組成的均一性：如樣品中只含有一種病毒DNA，其Tm

值范圍較窄，若混有其它來源的DNA，則Tm值范圍較寬第35頁/共100頁DNA的（G+C）含量在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于DNA分子中的（G+C）的含量（G+C）含量越高，G-C堿基對越多，Tm

值越高。因G-C堿基對具有3對氫鍵，而A-T堿基對只有2對氫鍵，DNA中（G+C）含量高顯然更能增強結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量，故（G+C）含量高的DNA，其變性Tm也高第36頁/共100頁DNA變性曲線第37頁/共100頁Tm與（G+C）含量的關(guān)系Tm與DNA中（G+C）含量存在著密切相關(guān)性Tm與（G+C）含量（X）百分數(shù)的這種關(guān)系可用以下經(jīng)驗公式表示（DNA溶于0.2mol/LNaCl中）:

X%（G+C）=2.44（Tm-69.3）核苷酸20Tm=4（G+C）+2（A+T）第38頁/共100頁DNA的復(fù)性（renature）指變性DNA在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為“退火”（annealing）DNA的復(fù)性不僅受溫度影響，還受DNA自身特性等其它因素的影響第39頁/共100頁影響復(fù)性的因素溫度和時間DNA濃度DNA序列的復(fù)雜度第40頁/共100頁溫度和時間變性

DNA溶液在比Tm

低25℃的溫度下維持一段長時間，其吸光率會逐漸降低。將此

DNA再加熱，其變性曲線特征可以基本恢復(fù)到第一次變性曲線的圖形。這表明復(fù)性與溫度和時間有關(guān)一般認為比

Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠離此溫度，復(fù)性速度就越慢第41頁/共100頁溫度和時間復(fù)性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫（如4℃以下），復(fù)性幾乎是不可能的核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性（單鏈）狀態(tài)。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利于復(fù)性第42頁/共100頁DNA濃度DNA復(fù)性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用，稱為“成核”“成核”速度與DNA濃度的平方成正比溶液中DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合“成核”的機會越大第43頁/共100頁DNA順序的復(fù)雜性簡單順序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）這二種單鏈序列復(fù)性時，互補堿基的配對較易實現(xiàn)順序復(fù)雜的DNA，如小牛DNA的非重復(fù)部分（一般以單拷貝存在于基因組中），這種復(fù)雜的特定序列要實現(xiàn)互補，顯然要比上述簡單序列困難得多第44頁/共100頁核酸分子的復(fù)雜性表示方法用非重復(fù)堿基對（bp）數(shù)表示核酸分子的復(fù)雜性。如：多聚（A）的復(fù)雜性為1，重復(fù)的（ATGC）n組成的多聚體的復(fù)雜性為4，分子長度是105核苷酸的非重復(fù)DNA序列的復(fù)雜性為105原核生物基因組均為非重復(fù)順序，故以非重復(fù)核苷酸對表示的復(fù)雜性直接與基因組大小成正比真核生物基因組中的非重復(fù)片段也是如此第45頁/共100頁核酸分子雜交分子雜交（簡稱雜交，hybridization）是核酸研究中一項最基本的實驗技術(shù)雜交的基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補關(guān)系形成雜交雙鏈分子（heteroduplex）雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間形成，也可在RNA與DNA鏈之間形成第46頁/共100頁雜交第47頁/共100頁核酸分子雜交雜交的本質(zhì)：就是在一定條件下使互補核酸鏈實現(xiàn)復(fù)性利用探針（probe）與靶DNA雜交，可識別靶DNA中的特異核苷酸序列探針：探針是指帶有某些標記物（如放射性同位素32P，熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素等）的特異性核酸序列片段第48頁/共100頁核酸分子雜交技術(shù)應(yīng)用在現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗中，探針的制備和使用是分子雜交技術(shù)的基礎(chǔ)核酸分子雜交作為一項基本技術(shù)，已應(yīng)用于核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的各個方面醫(yī)學(xué)上，分子雜交技術(shù)主要用于：

遺傳性疾病的基因診斷（genediagnosis）惡性腫瘤的基因分析傳染病病原體的檢測第49頁/共100頁3核酸的合成

DNA合成以DNA為模板合成DNAssDNA+dNTPdsDNA以RNA為模板合成DNARNA+dNTPRNA-DNAdsDNA第50頁/共100頁以DNA為模板合成DNA

DNA半保留復(fù)制第51頁/共100頁參與復(fù)制的酶類和蛋白因子DNA拓撲異構(gòu)酶Rep蛋白（解鏈酶）引物酶DNA聚合酶DNA連接酶單鏈結(jié)合蛋白dnaBdnaC第52頁/共100頁DNATopoisomeraseⅠ切開雙鏈中的其中一條張力釋放切點連接第53頁/共100頁DNATopoisomeraseⅡ切斷DNA雙鏈，釋放張力，再連接斷點消耗ATP時閉環(huán)形成超螺旋不消耗ATP時超螺旋解為閉環(huán)第54頁/共100頁Topoisomerase

作用第55頁/共100頁DNA聚合酶第56頁/共100頁DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ）1956年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點3’5’5’3’第57頁/共100頁DNA連接酶第58頁/共100頁常用的DNAligaseT4

DNAligase只以雙鏈DNA為底物，不能有核苷酸的缺失只催化3’端帶有羥基的斷點與5’帶有磷酸基的斷點的連接

既可連接粘性末端，又可連接平末端（是目前已知的唯一的可以連接平末端的DNA連接酶）最適pH：7.2-7.8需要ATP參加反應(yīng)

第59頁/共100頁復(fù)制過程第60頁/共100頁復(fù)制過程解旋解鏈引物酶作用合成引物DNA延長岡崎片段生成岡崎片段延長片段連接第61頁/共100頁第62頁/共100頁以RNA為模板合成DNA

逆轉(zhuǎn)錄第63頁/共100頁Polymerasechainreaction（PCR）原理變性退火延伸反應(yīng)體系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase

生物素標記的引物

和或和第64頁/共100頁

PCR技術(shù)的基本原理第65頁/共100頁PCR循環(huán)–

第一步–

加熱變性第66頁/共100頁靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)-第二步–

引物與靶序列退火第67頁/共100頁靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR循環(huán)-第三步-引物延伸第68頁/共100頁靶序列

靶序列BiotinBiotin第1個PCR循環(huán)完成后

得到兩個拷貝的靶序列第69頁/共100頁No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量第70頁/共100頁端粒第71頁/共100頁端粒第72頁/共100頁端粒酶是端粒復(fù)制所必須的一種特殊的DNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性能以hTR為模板，向染色體末端添加TTAGGG序列第73頁/共100頁端粒酶第74頁/共100頁端粒酶的作用第75頁/共100頁RNA合成

不對稱轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系DNA模板RNA聚合酶NTP（ATP、GTP、CTP、GTP）第76頁/共100頁RNA聚合酶第77頁/共100頁轉(zhuǎn)錄過程第78頁/共100頁原核生物轉(zhuǎn)錄起始區(qū)第79頁/共100頁mRNA成熟第80頁/共100頁mRNA成熟5’帽子3’polyA內(nèi)含子切除第81頁/共100頁rRNA基因的轉(zhuǎn)錄第82頁/共100頁rRNA加工第83頁/共100頁tRNA加工第84頁/共100頁4DNA損傷與修復(fù)

突變第85頁/共100頁突變第86頁/共100頁插入與缺失第87頁/共100頁T二聚體第88頁/共100頁C二聚體第89頁/共100頁損傷DNA的修復(fù)光復(fù)活切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)第90頁/共100頁光復(fù)活第91頁/共100頁二聚體切除修復(fù)第92頁/共100頁重組修復(fù)第93頁/共100頁SOS修復(fù)第94頁/共100頁

StructureofaddNTP(dideoxyn