酶起源應(yīng)用范圍L-天冬酰氨酶EruiniaCaratovoraEscherichiaColi治療急性淋巴癌過氧化氫酶Aspergillusniger牛奶滅菌后H2O2去除膽固醇氧化酶Nocardiahodochrous膽固醇漿液分析β-半乳糖苷酶KluyveromycesfragilisSaccharomyceslactis在牛奶/乳清中乳糖水解作用葡萄糖氧化酶AspergillusnigerPenicilluimnotatum葡萄糖漿液分析食品中氧去除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶Yeast臨床分析蔗糖酶SaccharomycesCerevisiae糖果、蜜餞青霉素?；窫scherichiaColi芐青霉素脫酰作用表1胞內(nèi)酶舉例細胞破碎必要性微生物細胞破碎第1頁藥品名宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細胞白血病和卡波濟肉瘤表2幾個由大腸桿菌表示胞內(nèi)重組藥品微生物細胞破碎第2頁細胞壁組成與結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌酵母菌霉菌壁厚/nm20~8010~13100~300100~250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40％～90％）、多糖、胞壁酸、蛋白質(zhì)、脂多糖（1％～4％）肽聚糖（5％～10％）脂蛋白、脂多糖（11％～22％）磷脂、蛋白質(zhì)葡聚糖（30％～40％）甘露聚糖（30％）、蛋白質(zhì)（6％～8％）、脂類（8.5％～13.5）多聚糖（80％～90％）脂類、蛋白質(zhì)微生物細胞破碎第3頁

圖1革蘭氏菌細胞壁結(jié)構(gòu)圖（a）革蘭氏陽性菌（b）革蘭氏陰性菌微生物細胞破碎第4頁圖2酵母細胞壁結(jié)構(gòu)示意圖M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖微生物細胞破碎第5頁微生物細胞壁形狀、強度取決于細胞壁組成以及它們之間相互關(guān)聯(lián)程度。內(nèi)因：連接細胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)共價鍵。外因：各類微生物遺傳信息、培養(yǎng)條件、菌齡、外界環(huán)境等。微生物細胞破碎第6頁破碎程度評價破碎程度慣用細胞破碎率（%）表示。破碎率定義為被破碎細胞數(shù)量占原始細胞數(shù)量百分比數(shù)，即：Y（%）=[（N0-N）/N0]*100其中N0——原始細胞數(shù)量；N——經(jīng)t時間操作后保留下來未損害完整細胞數(shù)量。微生物細胞破碎第7頁N0和N確定方法：直接計數(shù)法：經(jīng)過平板計數(shù)技術(shù)或血球細胞器上用顯微鏡觀察，直接對適當稀釋后樣品進行計數(shù)。間接計數(shù)法：在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來化合物量（eg.可溶性蛋白、酶等）。微生物細胞破碎第8頁細胞破碎技術(shù)微生物細胞破碎第9頁其它新細胞破碎方法：激光破碎法冷凍-噴射法高速相向流撞擊法微生物細胞破碎第10頁細胞聲波攪拌液壓冷凍壓力動物細胞7777革蘭氏陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭氏陽性芽孢桿菌5(4)54酵母3.5342.5革蘭氏陽性球菌3.5(2)32.5孢子2(1)21菌絲16(1)5表3細胞對破碎敏感度注：上述數(shù)字表示相對敏感度，括號則表示數(shù)字不確切。微生物細胞破碎第11頁慣用破壁方法珠磨法高壓勻漿法超聲波破碎法X-press法機械法非機械法酶溶法化學滲透法滲透壓法凍結(jié)融化法干燥法微生物細胞破碎第12頁慣用破壁方法——珠磨法作用機理：固體剪切作用圖3水平攪拌式珠麿機結(jié)構(gòu)示意圖1—細胞懸浮液2—細胞勻漿液3—珠液分離器4—冷卻液出口5—攪拌電機6—冷卻液進口7—攪拌槳8——玻璃珠微生物細胞破碎第13頁微生物細胞破碎第14頁

破碎作用遵照一級動力學定律：

微生物細胞破碎第15頁破碎速率和效率是全部操作參數(shù)函數(shù)，如：珠體大小、珠體裝量、細胞濃度、操作溫度、料液性質(zhì)、攪拌器轉(zhuǎn)速與構(gòu)型等。另外，與攪拌器設(shè)計和研磨腔結(jié)構(gòu)也相關(guān)系，如轉(zhuǎn)盤外緣速度等。微生物細胞破碎第16頁普通來說，磨珠越小，細胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并難以保留在研磨機腔體中。通常試驗室規(guī)模，珠體直徑為0.2mm很好，工業(yè)規(guī)模不得小于0.4mm。不一樣細胞類別及所需提取酶在細胞中位置等也是應(yīng)考慮原因。微生物細胞破碎第17頁有研究表明，減小磨珠直徑起先會提升卡樂酵母蛋白質(zhì)釋放速度，但磨珠再小一些，蛋白質(zhì)釋放速度反而稍有下降。eg.從酵母細胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，最好使用0.55-0.85mm大小玻璃珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶時，則最好使用較大尺寸（如1mm直徑）磨珠。微生物細胞破碎第18頁在一定范圍內(nèi)，增加珠體裝填量能夠提升細胞破碎率。但超出某一程度時，反不利于細胞破碎和蛋白質(zhì)釋放。為消除這種影響，必須提升攪拌器功率，這么又會增大釋放熱量，給破碎帶來困難。普通研磨機腔體內(nèi)填充密度控制在80%-90%，并隨珠體大小改變。微生物細胞破碎第19頁細胞濃度對懸浮液流變特征含有影響，最正確細胞濃度應(yīng)用試驗來確定。普通用NetzschLM20研磨機破碎時，細胞濃度控制在40%左右。微生物細胞破碎第20頁Currie等人研究表明，操作溫度控制在5-400C范圍內(nèi)對破碎物影響較小。常采取冷卻夾套和攪拌軸方式來調(diào)整磨室溫度。微生物細胞破碎第21頁作用機理：液體剪切作用慣用破壁方法——高壓勻漿圖5高壓勻漿機裝置圖微生物細胞破碎第22頁微生物細胞破碎第23頁微生物細胞破碎第24頁此方法中影響破碎主要原因是壓力、溫度和經(jīng)過勻漿器次數(shù)。有研究表明，當懸浮液中酵母濃度在450-750kg/m3時，溫度由500C提升到300C，破碎率約提升1.5倍。

微生物細胞破碎第25頁圖7細胞濃度及壓力大小對破碎率影響勻漿次數(shù)圖8勻漿次數(shù)對破碎效果影響微生物細胞破碎第26頁慣用破壁方法——超聲波破碎作用機理：空化現(xiàn)象由無數(shù)細小空化氣泡破裂而產(chǎn)生沖擊波現(xiàn)象。微生物細胞破碎第27頁超聲波振動在液體中傳輸音波壓強到達1atm時，功率密度為0.35w/cm2，這時超聲波音波壓強峰值可達真空或負壓，但實際上無負壓存在，所以在液體中產(chǎn)生一個很大力，將液體分子拉裂成空洞一空化核。此空洞非?？拷婵?，在超聲波壓強反向到達最大時破裂。

微生物細胞破碎第28頁圖10USB600型微電腦控制超聲波細胞粉碎機圖9超聲波細胞破碎儀結(jié)構(gòu)示意圖微生物細胞破碎第29頁振幅細胞懸浮液黏度表面張力被處理懸浮液體積珠粒體積和直徑探頭形狀和材料細胞懸浮液流速影響參數(shù)微生物細胞破碎第30頁慣用酶：溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等。慣用破壁方法——酶溶法作用機理：

利用酶分解細胞壁上特殊化學鍵。微生物細胞破碎第31頁eg.蝸牛酶——從蝸牛嗦囊和消化道中制備混合酶，含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20各種。微生物細胞破碎第32頁在一些情況下，不加外源酶也可使一些微生物發(fā)生自溶。

eg.谷氨酸生產(chǎn)菌（如乳糖發(fā)酵短桿菌）加入pH10緩沖液（0.028mol/LNa2CO3—0.018mol/LNaHCO3），配3%細胞懸浮液，加熱至700C，保溫攪拌20min，菌體即自溶。

微生物細胞破碎第33頁所用化學試劑：酸、堿、表面活性劑、脂溶性有機溶劑、EDTA鰲合劑、變性劑等。慣用破壁方法——化學滲透法作用機理：改變細胞壁或膜通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來。微生物細胞破碎第34頁酸、堿：用來調(diào)整溶液pH值，改變細胞所處環(huán)境，改變蛋白質(zhì)電荷性。有機溶劑：慣用是甲苯，被細胞壁脂質(zhì)層吸收后造成胞壁膨脹，造成細胞壁破裂。另外，丁醇、丙酮、氯仿等也慣用到。微生物細胞破碎第35頁表面活性劑：天然如膽酸鹽、磷酯，合成如SDS、Tween、TritonX-100等。變性劑：如鹽酸胍，與水中氫鍵作用，消弱溶質(zhì)分子間疏水作用。微生物細胞破碎第36頁eg.1.一些動物細胞（腫瘤細胞）可采取SDS、去氧膽酸鈉等破壞細胞膜；而細胞壁較厚，采取溶菌酶處理效果很好。2.用Triton從一個諾卡氏菌中選擇性地提取膽固醇氧化酶。微生物細胞破碎第37頁溫和化學滲透劑

溫和化學滲透劑普通是采取甘氨酸、丙氨酸等分子量較小非極性Ｒ基氨基酸。其破碎機理可能是因為小分子甘氨酸、丙氨酸更易滲透到細胞壁中,經(jīng)過氫鍵、范德華引力、靜電引力等化學親和力改變細胞壁結(jié)構(gòu),從而改變細胞壁和細胞膜通透性。微生物細胞破碎第38頁細胞類別變性劑清潔劑有機溶劑酶抗生素生物試劑鰲和劑革蘭氏陰性菌******革蘭氏陰性菌***酵母菌****