一基因工程概述二基因工程工具酶三克隆載體四微生物作為克隆載體的宿主五基因工程的常用技術(shù)和方法第5章基因工程及其應(yīng)用目前一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（重組DNA技術(shù)）；下游技術(shù)涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)及基因產(chǎn)物的分離純化過程。目前二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

基因重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。供體、受體和載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。目前三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點分離、擴增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種基因工程的目的：目前四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)工程細胞基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程發(fā)酵工程細胞工程分離工程酶酶工程分離工程天然細胞天然細胞生物活性物質(zhì)目前五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表達經(jīng)典基因工程第二代基因工程蛋白編碼基因的定向誘變蛋白質(zhì)工程第三代基因工程代謝信息途徑的修飾重構(gòu)途徑工程第四代基因工程基因組或染色體的轉(zhuǎn)移基因組工程目前六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

一基因工程育種

是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)良性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個細胞的方法。目前七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點基因克隆過程：１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴增與／或表達。目前八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點二基因工程常用的工具酶

基因工程所用到的絕大多數(shù)工具酶都是從不同微生物中分離和純化而獲得的。包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。目前十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點限制（restriction)與修飾(modification)體系(R/M)：寄主是由兩種酶活性配合完成的:

一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶目前十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當λ(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。目前十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

R/M體系的作用：

⑴保護自身的DNA不受限制；

⑵破壞外源DNA使之迅速降解。目前十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點1、核酸限制性內(nèi)切酶的分類I型限制酶的基本特點:反應(yīng)必須S-腺苷基蛋氨酸、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋，有特異識別位點但沒有特異切割位點，切割是隨機的。如EcoB和EcoKII型限制酶的基本特點：反應(yīng)必須ＡＴＰ和Ｍｇ２＋，具有特異性識別部位并切割。如EcoRI、HinfIIIIII型限制酶的基本特點：可以識別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24-26bp處切開DNA，切割位點沒有特異性。（一）限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）目前十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則

第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號。例：EcoRI:來自于EscheriacoliRY13的第一個限制酶。目前十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點形成粘性末端；形成平末端；

3、限制性內(nèi)切酶作用后的斷裂方式目前十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

粘性未端：切開后的兩段DNA各留下一個尾，這2個尾的核苷酸順序完全一樣，方向相反。它們之間是互補的，在適當條件下可以再連接一起。目前十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點SelICGCGThaICGCGSau3AIGATCCTAGBamHIGGATCCCCTAGG同裂酶(來源不同但識別相同靶序列)同尾酶(來源不同，識別靶序列不同但產(chǎn)生相同粘性末端)目前二十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點4、限制片斷的末端連接作用分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來。分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)形分子。目前二十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前二十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點5、影響核酸內(nèi)切酶活性的因素⑴DNA的純度

DNase的污染(Mg2+)a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量

b.擴大酶催化反應(yīng)的體系（稀釋）

c.延長酶催化反應(yīng)的保溫時間加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當?shù)臏囟取Ｄ壳岸揬總數(shù)一百四十五頁\編于八點⑵DNA的甲基化程度⑶酶切消化反應(yīng)的溫度大多數(shù)酶的標準反應(yīng)溫度37℃。⑷DNA的分子結(jié)構(gòu)某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍。目前二十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

⑸核酸內(nèi)切限制酶標準的緩沖液ａ.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：不正確的NaCl或Mg++濃度，會降低限制酶的活性，還可能導(dǎo)致識別序列的改變。ｂ.Tris-HCl：維持最適的pH值（pH＝7.4）。ｃ.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：維持酶的穩(wěn)定性。ｄ.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性。目前二十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點６、核酸內(nèi)切限制酶對DNA的消化作用⑴核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用。⑵核酸內(nèi)切限制酶對DNA的局部消化完全的酶切消化：識別序列n個堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對DNA的切割能達到每隔4n切割一次的水平。目前二十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

局部酶切消化：不讓核酸內(nèi)切限制酶對大量的DNA消化完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片斷產(chǎn)物，進行不完全的限制酶消化反應(yīng)。

a.縮短酶切的消化反應(yīng)的保溫時間

b.降低反應(yīng)的溫度（37--4）結(jié)束酶的活性

⑶核酸內(nèi)切限制酶對生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫）目前二十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（二）其它工具酶目前二十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點１、末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）

能催化5’脫氧核苷三磷酸進行5’－3’方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達幾百個。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA或雙鏈DNA。目前二十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前三十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

用途：ａ.催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標記DNA片斷的3’末端?？捎糜跍y序的終止，一位不含游離的3’-OH末端。ｂ.催化非放射性的標記物摻入到DNA片斷的3’-末端：生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生素蛋白結(jié)合物的接受位點。ｃ.用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。目前三十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點２、堿性磷酸酶來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當需要5’端同位素標記或為了避免DNA片段自身連接（或環(huán)化）時可進行脫磷酸反應(yīng)。目前三十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前三十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點３、S1核酸酶來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。４、反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。目前三十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點５、連接酶⑴用ＤＮＡ連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片斷。⑵用Ｔ４ＤＮＡ連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ連接酶連接。⑶先在DNA片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ連接酶連接。目前三十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點ＤＮＡ連接酶：能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。

只能連接切口（nick），不能連接缺口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。目前三十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點切口切口缺口缺口目前三十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺鍵DNA的腺苷酸復(fù)合物3’-OH對P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機理此反應(yīng)是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費兩個高能磷酸鍵目前三十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

連接酶的來源(1)DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的(2)T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP目前三十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二酯鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結(jié)合起來。

DNA連接酶對具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。目前四十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前四十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

影響連接酶作用的因素（1）反應(yīng)溫度：連接缺口的溫度：37℃

連接粘性末端的最佳溫度：4～15℃

（2）Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個單位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之間（3）提高外源片斷與載體的濃度的比值（10～20倍）目前四十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

粘性末端DAN片斷的連接由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。對載體的5’末端進行處理，用細菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進行共價鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個連接位點中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

目前四十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前四十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

平末端DNA片斷的連接（1）T4DNA連接酶（2）用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法目前四十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B中分別加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40個堿基目前四十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割。

目前四十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點銜接物連接法平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的回文結(jié)構(gòu)。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。BamHI或Sau3A/NotI目前四十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個核苷酸組成、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙銜接物：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比較方便。目前四十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點銜接物連接法目前五十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補齊，加入第二銜接物EcolI目前五十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

在用DNA銜接物連接法時，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆的基因切斷。目前五十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點DNA接頭（adapter）連接法：

1978年，美國康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對DNA接頭分子末端，進行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。目前五十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前五十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點DNA接頭連接法目前五十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

熱穩(wěn)定的連接從嗜熱高溫放線菌的菌株中分離出來的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。(1)寡核苷酸連接測定（oligonucletideligationassay,OLA）用兩個寡核苷酸探針，同已知序列的靶DNA雜交，探針在靶DNA分子的位置是相鄰的。(2)連接酶鏈式反應(yīng)（lingasechainreaction,LCR）；也叫連接擴增反應(yīng)（lingaseamplicationreaction）用寡核苷酸探針通過DNA連接酶的作用擴增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物。目前五十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點寡核苷酸連接測定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGTTACCTTCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCTAGTGACCTACCT

待擴增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽性信號無信號酶抗生素蛋白由于堿基錯配不能形成磷酸二酯鍵檢測單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性目前五十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈式反應(yīng)。樣品DNA、探針(4)94度變性目前五十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點6、DNA聚合酶(1)大腸桿菌DNA聚合酶(2)大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶(3)T4DNA聚合酶(4)T7DNA聚合酶(5)反轉(zhuǎn)錄酶目前五十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點共同點：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。目前六十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點(1)大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）

PolⅠ和PolⅡ的主要功能參與DNA的合成；

PolⅢ的功能同DNA的復(fù)制有關(guān)；

PolⅠ同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。目前六十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美國的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為1091000dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個片斷，一個具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一個具有全部

5’3’的外切酶活性。

目前六十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：a底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；bMg＋＋離子；c帶有3’-OH游離基團的引物鏈；dDNA模板：單鏈，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個或多個斷裂）。

目前六十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前六十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性（a）5’3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；（b）切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個核苷酸遠的一個鍵上發(fā)生；（c）DNA的合成可以增強5’3’的核酸外切酶活性；（d）5’3’核酸外切酶的活性位點同聚合作用的活性位點以及3’5’的水解作用位點是分開的。目前六十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。

對酶活的影響：

反應(yīng)物中缺乏dNTPs時，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，將會發(fā)揮作用。但對于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時，這種降解活性將會被5’3’的聚合酶活性所抑制。

目前六十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

目前六十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通過DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的DNA探針。

DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。當外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個5’核苷酸之后，聚合酶作用就會在缺口的3’一側(cè)補上一個新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動。

目前六十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

DNA雜交探針的制備

典型的反應(yīng)體系是。在25μl總體積中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標記的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；

PolＩ

：進行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的32p標記的核苷酸取代原有的未標記的核苷酸，最終從頭到尾都被標記。目前六十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

dNTP對PolＩ酶活性的影響

在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高濃度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（DnaseＩ數(shù)量）。

目前七十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點(2)Klenow片斷

Klenow片斷：是由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為761000dal的大片斷分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

目前七十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點Klenow片斷的主要用途：a、修補經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；b、標記DNA片斷的末端；c、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；d、DNA序列的測定。目前七十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點DNA片斷末端標記：具有3’隱蔽末端的帶標記得的DNA片斷

5’GATCT…3’3’A…5’在反應(yīng)物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道溫育后生成：

5’GATCT…3’3’32pGA…5’或是同時加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32pAGA…5’目前七十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

DNA片斷末端標記可以作為用凝膠電泳法測定分子大小的標記樣品。因為被標記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關(guān)。所以在限制酶消化過程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標記。不能夠有效的標記帶有5’突出末端的DNA分子。目前七十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點(3)T4DNA聚合酶a從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。b在沒有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’5’的方向從3’-OH末端開始降解DNA。如果反應(yīng)物中存在一種dNTP時，它的水解作用進行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補的核苷酸時就會停止。c在反應(yīng)過程中，通過T4DNA聚合作用，反應(yīng)物中的α-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

目前七十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

合成取代法優(yōu)于缺口轉(zhuǎn)移法：a不會出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而缺口轉(zhuǎn)移制備的探針會出現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)；b應(yīng)用適宜的核酸內(nèi)切限制酶切割，便可很容易的變成特定序列的探針。目前七十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點具EcoR1位點的DNA分子對DNA分子3‘端有控制的降解合成作用產(chǎn)生選擇性標記T4DNA聚合酶的取代合成法標記DNA斷末端及制備鏈的特異探針目前七十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點(4)反轉(zhuǎn)錄酶：具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA為模板合成cDNA；用來對5’突出末端的DNA片斷作末端標記。目前七十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前七十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前八十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

合成cDNA的主要步驟：a應(yīng)用poly(A)mRNA為模板，以12~18個堿基長的oligo(dT)片斷作為引物，加入反轉(zhuǎn)錄酶，合成出cDNA第一鏈;b用堿水解法除去mRNA模板，單鏈cDNA能自我折疊形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作第二鏈的引物，用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow聚合酶催化第二鏈cDNA的合成；c用SＩ核酸內(nèi)切酶消化除去單鏈區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。d通過同聚物或合成的銜接物，使DNA分子克隆到適當?shù)妮d體分子上。目前八十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點(5)T7DNA聚合酶：

1978年，S.Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細胞中純化出來的一種核酸酶。具有5’3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3’5’核酸外切酶活性。目前八十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點T7DNA聚合酶的用途：a用于對大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，聚合能力較強可延伸合成數(shù)千個核苷酸）b通過延伸或取代合成法標記DNA3’末端c將雙鏈DNA的5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。目前八十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

修飾的T7DNA聚合酶對天然的T7DNA聚合酶進行修飾，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。目前八十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點三克隆載體載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA；一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。目前八十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點載體應(yīng)具備以下條件：１、能在適當?shù)乃拗骷毎袕?fù)制；２、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入；３、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；５、對于表達型載體還應(yīng)具有與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。目前八十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體

載體

plasmidphageλcosmidBACYAC

插入片斷

(kb)523453501000目前八十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點pBR322plasmid目前八十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點左臂替換型載體右臂克隆位點phageλ應(yīng)用適當限制性內(nèi)切酶消化載體，除去可取代的DNA區(qū)段；同外源DNA片段連接；對重組體的λDNA分子包裝增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體。目前八十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點cosmid由λDNA片段（cos位點）和質(zhì)粒DNA共同組成具有λ噬菌體特性：克隆合適大小外源DNA后體外包裝可以導(dǎo)入大腸桿菌具有質(zhì)粒載體特性：能像質(zhì)粒樣復(fù)制，具有選擇性標記基因高容量克隆能力：45kb與同源序列的質(zhì)粒進行重組的能力：重組形成共合體目前九十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點四常用的基因工程宿主1）大腸桿菌2）枯草芽孢桿菌3）釀酒酵母4）動物細胞特點：生長迅速、極易培養(yǎng)、能在廉價培養(yǎng)基中生長，遺傳學(xué)及分子生物學(xué)背景十分清楚目前九十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點宿主細胞必須符合以下條件１、對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴格的限制；２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；４、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；５、容易導(dǎo)入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作的安全標準。目前九十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點如何獲得目的基因？cDNA基因克隆基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶消化機械隨機切割PCR方法獲得目的基因五基因工程的常用技術(shù)和方法目前九十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（一）cDNA基因克隆

cDNA文庫是指得到足夠多的分別克隆的cDNA片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細胞中各種mRNA的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細胞的cDNA文庫。目前九十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點1、沒有原核生物的cDNA文庫原核生物的

mRNA

非常不穩(wěn)定；原核生物的基因組文庫比較容易構(gòu)建，能包含所有基因的序列。２、cDNA

文庫對于真核生物的基因分析

cDNA文庫是只含有編碼蛋白的基因文庫

cDNAs

沒有內(nèi)含子基因可以在E.coli

中直接表達

得到mRNA

反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA目前九十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點３、mRNA

分離原理目前九十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點１）

傳統(tǒng)的分離方法是用oligo(dT)-纖維素柱分離總RNA２）把oligo(dT)-磁珠同總RNA混合，在強磁場下分離mRNA３）用蔗糖梯度離心mRNA核糖體復(fù)合體（溶解細胞）來分離mRNA４、三種分離mRNA的方法目前九十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前九十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（二）基因組DNA文庫純化基因組DNA

基因組DNA的片斷化:物理切割和限制性內(nèi)切酶

eukaryotes:從細胞核中去除蛋白,脂類和其他雜質(zhì).prokaryotes:直接提取目前九十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點HaeIII：5’-…GG/CC…

3’,Sau3A:5’-/GATC-3’,AluI:5’-…AG/CT…

3’,

BamH1:5’-G/GATCC-3’（三）限制性內(nèi)切酶消化1、將片斷的末端(粘性或平頭)和酶消化的載體連接2、酶切位點是否被修飾3、內(nèi)切酶消化的時間和用量取決于要插入片斷的大小范圍目前一百頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點兩個特點:第一是假如所需的基因含有所用限制酶的識別位點，那么這一基因?qū)⒈豢寺≡趦蓚€或數(shù)個片段中，給研究帶來一定的困難。第二一般常用的限制酶大多識別6個bp序列，切割DNA所產(chǎn)生的片段的平均大小相對比較小，因此整個基因文庫要含有非常大量的重組體，這樣應(yīng)用分子雜交法進行篩選就十分費事費時。雖然可以用限制酶進行部分消化，產(chǎn)生約20kb的片段，但這種方法必須掌握好酶解的條件。

目前一百零一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（四）機械隨機切割可以制備大片段的DNA（用噬菌體λ作載體約20kb，以cosmid作載體約45kb），從而克服上述的兩處缺點。不足之處：所制備的片段的末端順序是隨機的，還必須經(jīng)過末端修復(fù)，人工制造接頭等手續(xù)才能與載體DNA進行連接。

目前一百零二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

有一些序列不能被克隆

Example:1)序列缺乏酶切位點;2)目的基因包容在一個其大小范圍超出載體承載能力的DNA片斷上

Toolongforthevectorused目前一百零三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（五）PCR方法獲得目的基因聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）特點：在體外模擬細胞內(nèi)進行的DNA復(fù)制過程目前一百零四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點根據(jù)需擴增片段的兩端設(shè)計引物。使DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應(yīng)。特點：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。目前一百零五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點PCR原理PCR儀目前一百零六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點目前一百零七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點重組質(zhì)粒的構(gòu)建和克隆目前一百零八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

DNA分子的體外連接

DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。目前一百零九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點DNA連接酶DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA連接酶。T4DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、連接具有同源互補粘性末端的DNA片段；２、連接雙鏈DNA分子間的平端；３、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。目前一百一十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點重組DNA導(dǎo)入宿主菌

體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。目前一百一十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點原核生物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染E.coli的鈣轉(zhuǎn)化E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)導(dǎo)目前一百一十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點真核生物的轉(zhuǎn)染1.磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)2.電穿孔法3.基因槍轉(zhuǎn)染法4.激光微束穿孔法5.顯微注射法6.脂質(zhì)體介導(dǎo)法7.多聚物介導(dǎo)法目前一百一十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（一）遺傳轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化是指受體細胞直接攝取供體細胞游離的DNA片段，將其同源部分進行堿基配對，組合到自己的基因中，從而獲得供體細胞的某些遺傳性狀。目前一百一十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（二）自然轉(zhuǎn)化一般可人為地分為下列三個階段(1)感受態(tài)的出現(xiàn)

(2)DNA的結(jié)合與進入

(3)DNA的整合目前一百一十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點(三)操作步驟質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。2．取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無菌添加0.4ml2.5mol／LMgCl2，于37℃振蕩培養(yǎng)。3．將o.1mol／LCaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。目前一百一十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點4．當培養(yǎng)物OD600在o.5～o.8左右時，開始收獲細胞(大約需2～2.5h)．5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。6．取10ml培養(yǎng)物置2個冷離心管中棄去上清液。7．加入1ml0.1mol／LCaCl2，再加0.9mlCaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min離心10min，棄去上清液。目前一百一十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點9．加入1ml0.1mol／LCaCl2，重新懸浮細胞，置冰浴中保存。10．加入1～20μl待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

DNA溶液。11．在冰上放置20min，在37℃處理2min。再插入冰中，加入0.9m1肉湯37℃靜置培養(yǎng)90min。12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13．于37℃培養(yǎng)過夜。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。目前一百一十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（四）常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)1、自然系統(tǒng)2、人工誘導(dǎo)（完整細胞）（1）二價陽離子系統(tǒng)：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++輔助噬菌體，Tris+Ca2+（2）單價陽離子系統(tǒng)：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）凍融系統(tǒng)（4）Triton處理：人工誘導(dǎo)（PEG/原生質(zhì)體）目前一百一十九頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（五）轉(zhuǎn)染和感染

利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。目前一百二十頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點重組克隆的篩選與鑒定

基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達該基因的產(chǎn)物。目前一百二十一頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（一）抗藥性標志的篩選

如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetr

，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內(nèi)，該標志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。目前一百二十二頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（二）β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸，稱為α－肽，它表達β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當載體與宿主細胞同時表達兩個片段時，宿主細胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的α－互補。而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補，在含X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。目前一百二十三頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點（三）菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。（四）內(nèi)切酶圖譜鑒定經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。目前一百二十四頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點重組DNA的鑒定

遺傳學(xué)方法目前一百二十五頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

應(yīng)用核酸探針分離克隆的目的基因1.獲得探針2.轉(zhuǎn)膜3.雜交目前一百二十六頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點探針的來源某種生物實驗體系中分離到的基因序列，可作為從其它生物中分離相關(guān)基因的核酸探針。2.根據(jù)蛋白質(zhì)家族保守性，合成核酸探針。功能相同或相近的蛋白質(zhì)，存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段（保守區(qū)），往往由彼此相鄰的6~7個氨基酸組成。目前一百二十七頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點

３.探針的長度；要使探針與目的基因序列嚴格互補，最少的探針長度15~16個核苷酸，實驗中為保證足夠的特異性，通常使用17~20個核苷酸。４.簡并性；根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸組分合成的寡核苷酸探針，通常是混合物的形式。在這種探針庫中，只有一種是與目的基因完全互補的。目前一百二十八頁\總數(shù)一百四十五頁\編于八點